通过16s+rdna序列分析研究论文幽门螺杆菌根除疗法对肠道菌群的影响

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1、硕士学位论文通过16SrDNA序列分析研究幽门螺杆菌根除疗法对肠道菌群的影响硕士研究生：王慧指导老师：陈村龙教授张建中教授摘要目的和意义研究目前国内外普遍关注临床上大量采用的幽门螺杆菌根除治疗方案在肠道微生态平衡打破方面的作用及其对肠道微生态的影响。本研究通过16SrDNA基因序列分析观察质子泵抑$1J齐lJ(protonpumpinhibitor,PPI)、阿莫西林、克拉霉素组成的三联疗法根除治疗幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H．pylori)感染对肠道菌群的影响。通过研究三联疗法根除H．pylori感染对肠道微生态平

2、衡打破方面的作用及其对肠道微生态的影响，对于指导临床用药，研究新的抗H．pylori感染治疗方法以及减少药物副作用等具有重要意义；同时为构建环境和临床标本中微生物的快速测定基因芯片提供研究基础。方法1．研究对象20一25名志愿者被告知将接受一次13C尿素呼气试验，该试验对机体无任何损害，对H．pylori感染诊断的敏感性和特异性高于90％。这些志愿者均填写知情同意书并接受一次问卷调查，合格的志愿者符合下列标准：13C呼气试验阳性，且近5周内未使用任何制酸剂、益生菌、抗生素或和抗微生物制剂，消化系统无其它器质性疾病，消化道未进行过手术活动，无

3、酗酒史，无糖尿病及影响肠道菌群的其它问题。最后共有12名志愿者符合情况，包括8名男性和4名女性，中文摘要平均年龄为34岁(年龄范围为23．58岁)。所有的志愿者都填写了知情同意书。被13C呼气试验证明为H．pylori感染的12名志愿者在浙江大学医学院第一附属医院口服给予为期7天的标准三联疗法(阿莫西林1000mg，2次／天，饭后服；克拉霉素500mg，2次／天，饭后服；雷贝拉唑20mg，2次／天，饭前服)，对治疗期间出现的药物副作用详加记录。这些志愿者治疗期间的饮食习惯与平常一样，治疗期问所有志愿者不再服用任何制酸剂、益生菌、抗生素，治疗

4、结束后4周复查13C呼气试验评价是否根除成功。2．标本收集每个志愿者在接受治疗前一天(0天)和一周疗法结束后一天(第8天)各采集粪便lO克。采集的粪便与10ml生理盐水混匀，分装10支(每支lml)至1．5ml液氮冻存管于液氮中保存。标本采集完全后，运送到中国疾病预防控制中心传染病控制所诊断室的实验室，所有粪便标本．72℃保存。3．细菌DNA提取每份标本取0．5ml(约相当于0．59粪便)用GENMED粪便细菌DNA分离试剂盒自粪便标本中提取细菌总DNA。提取的核酸用紫外分光光度计测定其浓度。4．PCR扩增及其产物纯化利用2个通用引物扩增细

5、菌16SrRNA基因的全长，PCR扩增选用细菌通用引物序列为：8F(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG一3’)和1492R(5’一ACGGTl’ACCTTGTl'ACGACTT-3’)，该引物对绝大数细菌16SrDNA基因序列具有特异性。PCR反应混合液包括0．5山EXTaq酶(2．5uml一，TaKaRa生物，中国大连)，5txl10xEXTaqBuffer(plusM92+)，4川dNTPmixture(各2．5MM)，上下游引物(10}tmol／L)各0．5}tl，8-Methoxypsoralen(8-MOP)0．5川(

6、2．5mg／m1)，去离子水定容至491xl，将未加模板的混合液在室温下用紫外线照射后再加1川模板；PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s、52℃退火1min、72℃延伸1．5min，共25个循环；72℃最后延伸5min，阴性对照用Ⅱ硕士学位论文去离子水代替模板，扩增反应在MyCyclerTMthermalcycler上进行。PCR产物用经GelRedTM染色的1％琼脂糖凝胶电泳(缓冲液为lxTAEbuffer)鉴定，图像用GelDoe凝胶成像仪观察，1．5kbDNA条带自凝胶上切下，PCR产物纯化按QiaquickPCRg

7、elextractionkit说明书操作步骤进行。5．16SrDNA克隆文库的建立和序列分析经纯化的PCR产物与pGEM—Teasy载体连接，然后按操作说明转入大肠杆菌DH5a感受态细胞，重组的克隆子在LB琼脂平皿(包括100mg／ml的氨苄青霉素，20mg／ml的X．Gal和24mg／ml的IPTG)上生长，每份标本随机挑选100个白色克隆子传代于含100mg／ml氨苄青霉素的LB平皿上，37"C培养过夜后，将克隆子送公司测序。短期4"C保存连接后转化克隆平皿，若测序中需补充克隆时，进行补充挑选。用CHIMERA．CHECK程序检测序列中

8、可能出现的嵌合体，每个16SrDNA序列(大约1500bp)同时用GenBank的BLAST和RDP数据库进行比对，若某个序列在两个数据库中同时为一类则该序列归为此类，若某个序列