植物病原真菌cyp51的克隆表达及多克隆抗体的制备

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1、⑨硕士学位论文MASTER’STHESIS摘要甾醇14甜去甲基化酶(也称P45014蹦，伽1)是唯一的广泛存在于细菌、真菌、植物和动物中的细胞色素P450家族成员。它被视为最古老的细胞色素P450家族成员。它催化甾酵的14a．去甲基化反应。甾醇14a．去甲基化酶是真菌麦角甾醇合成过程的关键酶。抑制真菌甾醇14(x．去甲基化酶将会阻碍真菌麦角甾醇的合成。麦角甾醇的缺失会损害细胞膜结构和功能，最终导致真菌死亡。目前农业上14ct．去甲基化酶抑制剂(14a．demethylationinhibitors，DMIs

2、)类杀菌剂即是通过抑制真菌{；{醇14ct．去甲基化酶而发挥杀菌抑菌的作用。本文分别从柑橘绿霉菌和玉米黑粉菌中克隆柑橘绿霉菌CYP51cDNA和玉米黑粉茵CYP51基因。本实验采用RT．PCR方法，从柑橘绿霉菌中成功克隆了柑橘绿霉菌CYP51eDNA序列，成功构建了柑橘绿霉菌CYP51重组表达载体pE28GL，转入大肠杆菌中表达，SDS．PAGE分析表明，在58kDa处有一特异性蛋白表达条带。特异性蛋白大小与文献报道一致。重组蛋白表达量可达到菌体总蛋白的20％。在优化条件下，重组柑橘绿霉菌CYP51蛋白经N

3、i-NTA琼脂糖亲和层析柱一次纯化后，SDS．PAGE分析表明，纯化的目的蛋白基本上为单一谱带。用纯化重组柑橘绿霉菌Q旧51蛋白免疫新西兰白兔，成功制备了重组柑橘绿霉菌CYP51蛋白多克隆抗体。Westernblot结果表明在58kDa处检测到特异性的杂交条带。表明重组柑橘绿霉菌C：YP51蛋白有较强的免疫学活性。同时本文从玉米黑粉菌中分别克隆得到一缺失102个核苷酸的玉米黑粉菌CYP51基因以及完整CYP51基因。并分别构建了重组表达载体pE30YHl和pE28YI-12K。植物病原真菌CYP51的克隆和

4、表达对于研究CYP51结构和功能从而为设计开发新型的具有更强结合作用和更高选择性DMIs类杀菌剂提供了理论依据。同时也为研究植物病原真菌对现存DMIs类杀菌剂产生的抗性机制奠定了良好的基础。，。关键词：柑橘绿霉菌，玉米黑粉菌，甾醇14a．去甲基化酶，克隆与表达，多克隆抗体，14Q．去甲基化酶抑制剂⑨顾士学位论文MASTER’STHESISAbstractSterol14Q-demethylase(othernames：P45014DM；CYP51)istheonlymemberofthecytochrome

5、P450superfamilypresentinanimals，plants，fun#andbacteriaandconsideredtobethemostancientmemberofthesuperfamily．Inallcasesitcatalyzesathree-stepreactionofsterol140t-demethylation．Infungi，thecomplexsterol140t—demethylationreactionpresentsoneofthekeystepsinstero

6、lbiosynthesis，anessentialmetabolicpathwayproducingergoster01．Theactionmodeof14a-demethylaseinhibitors(DMIs)involvesselectiveinhibitionofthefungalsterol14ct-demethylaseOVertheplantenzymeactivityduringtreatment．Inhibitionofsterol14a—demethylationbyDMIfungici

7、desresultinthedepletionofergosterol，accumulationofabnormalsterolintermediates．Consequentlythegrowthoffhn舀wasarrested．ThisstudyreportedthatthePenicilliumdigitatumCYP51eDNAandUstilagomaydisCYP51DNAwereclonedfrom只digitatumandUmaydisrespectively．只digitatumCYP5

8、1eDNAwasclonedbyRT-PCR(reversetranseription-polymerasechainreaction)andexpressedin￡coliusingthepET-28expressionsystemyieldingrecombinantprotein(516aminoacidresidues)withamolecularweightapproximate58kDa．Therec