应用人脐带血间充质干细胞修复小鼠皮肤创面的实验研究

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1、第三军医大学硕士学位论文应用人脐带血间充质干细胞修复小鼠皮肤创面的实验研究摘要大面积烧伤、创伤、糖尿病、褥疮等原因常造成皮肤正常组织结构及完整性的破坏而形成创面(包括难愈性溃疡)。在无足够自体皮肤进行移植等限制下，如何及时有效的修复创面、重建愈后皮肤正常组织结构以尽可能达到恢复皮肤正常功能的生理性愈合，是目前创面临床治疗的难点。间充质干细胞(MSC)是来源于中胚层并具有多分化潜能的一类干细胞，广泛的存在于人骨髓、脐带血及胚胎前体组织中，已被应用于组织工程和细胞替代治疗。近年来研究发现，MSC可以跨越胚层界限向皮肤等上皮组织细胞分化，参与组织损伤的修复和功能重建。脐带血间充质干细胞(

2、uCBMSC)较骨髓来源的MSC更接近胚胎干细胞，具有来源更充足、抗原性更低，无创获取等优势，作为一种新型的种子细胞而倍受关注。本研究中，我们从新生儿脐带血中分离培养MSC，Brdu标记示踪后移植入皮肤缺损创面的SCID小鼠体内。通过检测创面愈合率和皮肤新愈组织内供体细胞的分布及分化情况，探讨了uCBMSC在体内向表皮细胞分化并促进创面修复的可能性，为临床应用人脐带血间充质干细胞修复创面提供理论及实践依据。材料和方法一、UCBMSC体外分离培养应用Fic01l—Hypaque密度梯度离心法从新鲜脐带血中分离MNC，接种于胎牛血清包被过的塑料培养皿中，采用含15％胎牛血清、100U／

3、ml青霉素G、looug／IIll链霉素的DMEM／F12培养基(PH值7．2—7．4)，在37。C、5％C02及饱和湿度环境下培养。过夜即全量换液，弃去未贴壁细胞。此后每3天换液一次。5—7天后在显微镜下挑取出现的MSC克隆，2．59几胰酶消化吹散，同前条件传代培养。待细胞生长至80一90％融合时，按1：3比例消化传代培养。二、流式细胞技术鉴定UCBMSC第三军医大学硕士学位论文消化、收集P7代UcBMSC，应用相关抗体染色后在BDCaliber流式细胞仪检测细胞表面分子CD29、CD34、CDl05、HLA—DR的表达。三、不同代数UCBMSC体外增殖能力的测定消化收集细胞后以

4、1×103cell／孑L接种于24孔板中，3d换液一次，每隔1天随即抽取2孔消化计数、取平均值，连续记录12天。以细胞数为纵轴，时间为横轴，绘制P3、P10代以及Brdu标记的PlO代ucBMsc细胞生长曲线，比较不同代数以及Brdu标记后细胞的增殖能力。四、BrdU标记UCBMSC将新鲜消化下来的P9代UCBMSC采用含终浓度5umol／L的BrdU、15％胎牛血清、100Ufml青霉素G、100u∥m1链霉素的DMEM／F12培养基，在37℃、5％c02及饱和湿度环境下培养。此后3d换液一次，待细胞生长至60％融合时，免疫细胞化学染色检测BrdU阳性细胞率。同时如上检测BrdU

5、标记后对细胞增殖的影响。五、移植UCBMSc修复SCID小鼠全层皮肤缺损创面1．创面种植UCBMSC取4周龄雄性SCID小鼠8只，于小鼠背部中线两侧各制造1×2cm2全层皮肤缺损。消化收集BrdU标记的P9代UcBMSC，以PBs调整细胞悬液密度为2．5×106／m1，将200ul细胞悬液均匀涂布至左侧创面(治疗组)，右侧仅涂布PBS(对照组)，双侧均以油纱覆盖。于术后7、14天用无菌透明膜描印创面大小，计算比较两组创面愈合率。2．尾静脉注射移植UcBMSC按上述方法建立皮肤全层缺损动物模型，设立实验组和对照组各8只。通过尾静脉注射将BrdU标记的P7代UCBMSC移植入实验组SC

6、D小鼠体内，细胞数量为2．5×105／只，对照组注入同体积PBS，创面均以猪皮缝合覆盖。六、组织学检查于移植术后第7、14、28天取治疗组和对照组小鼠创周新愈皮肤组织活检，行常规病理检查(HE染色)。在光镜下(×400)观察两组创面新愈组织表皮层厚度以及细胞层数，比较两组创面愈合情况。七、免疫组织化学染色于移植术后第7、14、28天取两组创面新愈皮肤组织；于尾静脉注射UCBMSC术后第28天治疗组小鼠远离创面的正常皮肤组织及心、肝等脏器，石蜡包埋切片，sABc法免疫组化染色检测BrdU阳性细胞在上述组织的分布情况。并取尾静脉注射术后不同8第三军医大学硕士学位论文时相点治疗组创面新愈

7、组织切片，在光镜下(×400)每隔500¨m计数一个视野内表皮基底层BrdU阳性细胞数，连续计数3个视野，求其平均值。另行免疫组化双染色检测BrdU阳性细胞及其K19和广谱角蛋白的表达情况，初步探讨UCBMSC在体向人表皮细胞分化的可能机制。结果一、UCBMSc体外分离培养、标记及表面标志物的鉴定优化的分离培养条件传至第3代可以获得较均一的uCBMSC。细胞形态均一，为梭形或成纤维样，呈漩涡样生长。流式检测显示UCBMSC表达CD29(90．30％)、CDl05(86