结核分枝杆菌cfp10esat6cfp21融合蛋白的克隆表达与其诊断应用

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2、』位扯pET21a(+)中，最终获得pET21a(+)-CFPl0一ESAT-6-CFP21重组质粒；优化表达条件，亲和层析方法纯化得到重组蛋白，经复性及去除内毒素后，将其作为T淋巴细胞刺激抗原，利用酶联免疫吸附试验检测重组抗原刺激后，48例结核病患者、30例非结核肺部疾病患者及32例健康对照者全血中IFN-),的释放水平。结果：成功克隆了编码CFP21和CE的基因，构建了表达质粒pET21a(+)．CFPl0．ESAT-6．CFP21，IPTG诱导在大肠杆菌中得到高水平表达CE21蛋白包涵体，经SDS．PAGE分析后分子量为41kDa，与预期大小一致。纯化得到高纯度

3、的CE21蛋白，复性后测得蛋白含量为2．42mg／mL。CE21融合蛋白全血标本IFN吖的检测，结核组阳性率为72．92％，非结核疾病对照组和健康对照组阳性率分别为3．33％和3．13％。结论：成功在大肠杆菌中获得结核分枝杆菌CE21融合蛋白。体外IFN吖的检测证明该融合抗原具有良好的结核病检测价值。关键词：结核分枝杆菌；融合蛋白；诊断；克隆；IFN吖作者：指导教师：周舟胡忠义教授Methods：ThegenesencodingCFP21andCFPIO·ESAT-6(CE)proteinwereamplifiedbyPCR,clonedintovectorpMD18

4、一TrespectivelyandthenclonedintoexpressionvectorpET21a(+)twice．RecombinantpET21a(+)·CFPIO—ESAT-6-CFP21vectorWaSobtainedandtransformedintoE．coliBL21(DE3)．Afterexpression,purification,refoldingandremovingendotoxin，CE21fusionproteinWaSused缌astimulatingantigentodetecttheconcentrationofIFN吖in

5、wholebloodsamplesofTBpatients(n=48)，otherpulmonarydiseaSepatients(n_30)andhealthysubjects(1f32)byELISA．Results：TherelativemolecularweightoftheCE21fusionproteinWaSapproximately41kDaanalyzedbySDS—PAGE，consistent、)l，inlanticipation．Afterpurification，concertrationassayandrefolding，theconcer

6、trafionoftherecombinantproteinis2．42mg／mL．AccordingtotheresultsofIFN吖detectioninwholebloodsamples，thedetectingpositiverateofCE21fusionproteininTBpatientsWas72．92％，andthatindiseaseandhealthycontrolswere3．33％and3．13％．Conclusions：RecombinantCE21fusionproteinWasobtainedsuccessfullyinE．coliB

7、L21(DE3)．ItCanbeconcludedthatthefusionproteinhadapromisingdiagnosisvalueoftuberculosisbasedontheresultsoflFN-ydetection．Keywords：Mycobacteriumtuberculosis；Fusionprotein；Diagnose；Clone；I烈吖；Writtenby：ZhouZhouSupervisedby：HuZhongyiH目录引言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l第一部分结核分枝杆菌CFPl