腺病毒介导的人骨形成蛋白-7基因转染对人牙髓细胞增殖与分化的研究

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1、中山大学硕士学位论文腺病毒介导的人骨形成蛋白-7基因转染对人牙髓细胞增殖与分化的研究姓名：秦伟申请学位级别：硕士专业：口腔临床医学指导教师：林正梅20060518腺病毒介导的人骨形成蛋白．7基因转染对人牙髓细胞增殖与分化的研究腺病毒介导的人骨形成蛋白．7基因转染对人牙髓细胞增殖与分化的研究专业：1：3腔临床医学硕士研究生：秦伟导师：林正梅副教授摘要目的：构建人骨形成蛋白一7(humarlmorphogeneticprotein，hBMP．7)腺病毒载体并制备重组病毒液，检测经腺病毒介导hBMP．7基因转染的人牙髓

2、细胞(dentalpulpcells，DPCs)00=5'b源hBMP一7蛋白的表达，探讨hBMP一7基因转染对DPCs增殖及向成牙本质细胞分化的调节作用。为进一步开展牙髓暴露基因治疗的体外及临床研究提供实验依据。研究方法：分别双酶切pSPORT6一hBMP．7质粒和PSU．CMV质粒，回收并纯化hBMP一7cDNA片断和PSU—CMV质粒的大片断，使二者连接获得含有hBMP．7基因的重组穿梭质粒载体，酶切鉴定及测序以证实构建是否成功。采用位置特异性重组方法构建hBMP．7基因重组腺病毒载体。用脂质体介导PSUC

3、MV-hBMP．7和Pbhge3共转染293细胞产生hBMP一7基因重组腺病毒，经293细胞扩增，纯化制取高滴度重组腺病毒。以相同的方法扩增和纯化Ad．EGFP。检测Ad．EGFP对牙髓细胞的转染效率，以确定Ad—hBMP．7的MOI，用携带外源性目的基因的腺病毒感染人牙髓细胞，Westernblot鉴定重组腺病毒目的基因的表达情况。四唑盐比色法(MTT)、酶动力学法、VonKossa染色及半定量RT-PCR分别检测转基因细胞的增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性、钙化结节和牙本质涎磷蛋白mRNA(DSPPmRNA)的

4、表达情况。结果：用位置特异性重组方法成功构建了携带hBMP一7基因的重组腺病毒载体(Ad．hBMP一7)，其滴度约为1785x109pfu／ml，确定Ad．hBMP．7对人牙髓细胞的最佳感染复数为75；Westernblot检测出人骨形成蛋白．7的表达；经Ad—hBMP．7转染的人牙髓细胞增殖能力无明显改变，同时其合成ALP的能力能腺痫毒介导的人骨形成蛋白．7基因转染对人牙髓细胞增殖与分化的研究够得到显著提高，矿化结节形成，DSPPmRNA的表达呈剂量和时间依赖性。结论：Ad。hBMP．7转染人牙髓细胞后可高效稳

5、定表达。Ad—hBMP一7显著促进体外培养的人牙髓细胞向成牙本质细胞分化，而对细胞的增殖无明显改变。关键词：骨形形成蛋白；腺病毒载体；牙髓细胞；基因治疗；组织工程腺病毒介导的人骨形成蛋白一7基因转染对人牙髓细胞增殖与分化的石Jf究Studyofadenovirus--mediatedhumanbonemorphogeneticprotein-·7onproliferationanddifferentiationofhumandentalpulpcellsMajor：StomatologyName：QmWeiSup

6、ervisor：AssociateProf．LINZheng-meiABSTRACTObjective：TodetecttheexpressionofhBMP-7inhumandentalpulpcellstransferredbyadenoviralvectormediatedhBMP-7gene．Theeffectsofadenovirus-mediatedhumanbonemorphogeneticprotein一7onproliferationanddifferentiationofhumandental

7、pulpcellswerealsoelucidatedatthesametime．Methods：hBMP一7cDNAwassubclonedintoshuttleplasmidPSU-CMVtoconstructrecombinantshuttleplasmidpSUCMV-SPORT6一hBMP-7．ThentherecombinamshuttleplasmidandadenovirusgenomicplasmidPbhge3，3Crewerecotransfectedinto293cellstoconstr

8、uctrecombinantadenovirushBMP一7bysitespecialrecombination．Theviralstockreproducedin293cellsandwasconcentratedbycesiumchlorideultracentrifugation．ThePCRtechniquewasusedtodetecttargetgenefra