鼠抗人pd1单克隆抗体的研制与人可溶型pd1分子生物学特性的研究

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1、苏州大学学位论文使用授权声明lIIIII]1111IIIIIIIl、t1731667本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在——年一月解密后适用本规定。非涉密论文曰论文作者签名：塑

2、盘翌日导师签名：。燃日期。鼠抗人PD．1单克隆抗体的研制及人可溶型PD．1分子生物学特性的研究中文摘要协同刺激分子根据其结构的不同，一般分为TNF／TNFR和B7／CD28两大超家族。近几年，B7／CD28家族成员不断扩大，其中PD．1是新近发现的协同刺激分子之一。PD．1分子属于CD28家族，是55KDa的I型跨膜糖蛋白，胞外区包含一个IgV样结构域，此结构域及胞外段的糖基化被认为在与配体的结合中发挥重要的作用。一系列的研究表明，PD．1通过与其两个配体PD。L1和PD．L2的作用而抑制T、B细胞的活化及细胞因子的产生，在维持机体的外周耐受发挥至关重要的作用。同时，PD．1分子与一系列疾

3、病的免疫病理发生和发展密切相关。因此，PD．1分子成为近年来免疫学研究的热点，有望成为肿瘤、自身免疫性疾病和病毒感染性疾病的免疫干预治疗的有效靶分子。本课题研究以高表达人PD．1分子的基因转染细胞L929／PD．1作为免疫原，常规免疫BALB／e小鼠，采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合，以L929／PD．1作为抗体筛选细胞，L929／mock为对照细胞，经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养，筛选出分泌特异性鼠抗人PD．1单克隆抗体的杂交瘤细胞株命名为6E2mAb和1085mAb，Western．blotting分析显示，两株抗体都可以特异性识别L929／PD．1细

4、胞上大约55KD大小的蛋白质，而不能识别L929／moek。抗原位点竞争抑制实验提示2株单抗与商品化的anti．PD．1．PEmAb识别细胞抗原结合位点不同，对6E2mAb生物学功能的研究结果提示，该单抗能够识别活化T细胞表达的PD．1分子，且在体外能够显著抑制T细胞的增殖和细胞因子的分泌，是一株具有较好效应的功能性单克隆抗体。在此基础上，利用两株识别不同抗原表位的鼠抗人PD．1单克隆抗体6E2和1085分别作为包被抗体和检测抗体，采用双抗体酶联免疫夹心法，成功研制出特异性检测人sPD．1的ELISA方法，并对其稳定性、精确性和特异性进行分析。结果显示，在抗原浓度为1．56．100ng／m

5、l范围内有良好的线性关系，并具有良好的稳定性、准确性和特异性。鉴于至今尚无商品化sPD．1的检测试剂，该试剂盒成功地研制，具有重要的研究和运用价值。通过RT-PCR的方法获得人PD．1全长(PD．1)基因，设计特异性引物，PCRIIl，r鼠抗人PD．1单克隆抗体的研制及人百】溶型PD．1分子生物学特性的研究英文摘要PreparationofMouseAnti--humanPD--1MonoclonalAntibodyandCharacter娩ationofHumanSolublePD-1AbstractThemostintensivelycharacterizedCMsarethoseof

6、theB7／CD28family．ThePD-1receptor,whichbelongstoCD28family，isa55KDatypeItransmembraneproteinofIgsuperfamilywithailextracellularIgV—likedomain．Thedomainplaysallimportantroleinbindingtoligands．LigationPD-1埘tllitstwoligands，PD-L1andPD-L2，triggersinhibitorysignalstoinhibitTandBcellactivationandproducti

7、onofcytokines．PD-LandPD-1interactioninvolvesinmaintenanceofperipheraltolerance．Inaddition，thePD-1expressionplaysanimportantroleintheoccurrenceanddevelopmentofaseriesofdiseases．StudiesonmousemodelsshowedthatPD一1re