红背叶根有效部位提取与体外抗乙肝病毒作用机制的研究

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1、硕士学位论文{lIIIIIIIIIIIIIIII]11IY1997829红背叶根有效部位提取及体外抗乙肝病毒作用机制研究硕士研究生：张艳平指导老师：吕志平摘要中文摘要红背叶根作为岭南地区常用的中草药之一，主要用于治疗与肝脏相关的疾患。以红背叶根提取物为原料的固体口服制剂具有抗肝炎病毒和阻止肝纤维化的作用，但目前尚未见关于其化学成分、药理作用方面的文献报道，转基因HepG2．2．15细胞株载有HBV全基因组，能够进行病毒复制并稳定分泌感染性病毒颗粒及HBsAg和HBeAg，因此被广泛用于抗病毒药物的筛选和疗效评价。我们以HepG2．2．15细胞作

2、为靶细胞，采用MTT比色法观察红背叶根水提物，醇提物，生物碱含药血清对HepG2．2．15细胞的毒性作用；并分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测定细胞培养上清中HBsAg，HBeAg的含量，以此评价红背叶根提取物体外抗HBV的作用。现先报告如下：实验一：HepG2．2．15细胞株培养体系的建立目的使HepG2．2．15细胞正常生长，为红背叶根水提物，醇提物，生物碱含药血清干预实验做准备。方法分为细胞复苏、细胞培养、细胞传代、细胞冻存四个步骤。结果细胞复苏后三周内生长速度较缓慢，但传代后生长状态良好，可用于药物干预实验。实验二：细胞培养上

3、清液中I旧sAg和HBeAg分泌曲线的绘制目的观察HepG2．2．15细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的分泌情况。中文摘要方法HepG2．2．15细胞经传代培养，在其贴壁后l"6d分别收集细胞培养上清液，-20℃保存，统一检测。使用ELISA法检测细胞培养上清液中的I-msAg和HBcAg，显色反应后，酶标仪读取A450nm值，绘制分泌曲线。结果HcpG2．2．15细胞在贴壁后l"--6d，其培养上清液中的HBsAg和HBeAg通过酶标仪所测的A450nm值逐渐增大，分泌曲线呈现逐渐上升趋势。实验三：红背叶根各种提取物制备及含药血清制备目

4、的制备红背叶根各种提取物及其含药血清。方法1．红背叶根各种提取物制备红背叶根各种提取物制备：红背叶根采自广东惠州，经南方医科大学中药鉴定与药用植物教研室鉴定为大戟科植物红背山麻杆Alchomeatrcwioides(Bcnth．)Muell．-Arg．的根。100％红背叶根制剂，取红背叶根原药材加8倍水，加热回流2h,残渣再加8倍水加热回流2h，合并提取液后过滤，浓缩成体积与原药材质量比为1／l的流浸膏。按药效学原则制成水溶液含生药量10．49／kg，冷藏备用。红背叶根醇提物制备：100％红背叶根制剂，取红背叶根原药材加8倍量95％乙醇，用加热

5、回流2h,残渣再加8倍乙醇加热回流2h,合并提取液，回收乙醇，得到乙醇提取物，按与原药材的比例配置成一定浓度混悬水液，(含生药量0．459／m1)，冷藏备用。生物碱提取：红背叶根粗粉5009，95％乙醇浸泡6h后，回流提取2次，每次120分钟，合并2次滤液，然后加入1／2体积，5％盐酸，分离出杂质及酸水提取液，酸水提取液中加入浓氨水碱化，调节PH到9，得到非生物碱部位和游离生物碱部位，游离生物碱部位，用CHCL3萃取三次，分别按1：1，1：2，1：3体积萃取，得到水相及生物碱部位，蒸馏水沈脱3次后，旋转蒸发回收氯仿，得到总生物碱部位，取该部位少

6、许加入4支小试管，各管依次加入生物碱沉淀剂：碘化钾、碘化汞钾、硅钨酸试剂和碘化铋钾各2滴。该部位出现不同程度沉淀反应，分别为：棕红色，白色，白色，桔红色。说明该部位部位含有生物碱成分，重0．229，按药效学原则制成水溶液含生药量0．449／kg。Ⅱ硕士学位论文2．红背叶根各种提取物含药血清的制备54只健康Wistar雄性大鼠适应性喂养l周后，称重，随机分为9组，每组6只，通过给予大鼠分别灌服红背叶根水提物低剂量，红背叶根水提物中剂量，红背叶根水提物高剂量，红背叶根醇提物低剂量，红背叶根醇提物中剂量，红背叶根醇提物高剂量，生物碱，恩替卡韦和生理盐

7、水7天后，分离药物血清，制红背叶根水提物低剂量、红背叶根水提物中剂量、红背叶根水提物高剂量、红背叶根醇提物低剂量、红背叶根醇提物中剂量、红背叶根醇提物高剂量、生物碱、阳性对照恩替卡韦和空白血清，血清经56℃，30min灭活，置．20℃冰箱保存，待测备用。结果：各组含药血清质地均匀，清稀合格，可用于药效干预实验。实验四：药物对细胞的毒性实验目的采用MTT方法，观察各种红背叶根各种提取物含药血清对HepG2．2．15的细胞毒性作用。方法HepG2．2．15细胞购自博慧斯生物医药有限公司，取第4~8代细胞，以lxl04个／L，每孔2001d_,接种于

8、96孔培养板，随机分为10组，细胞贴壁后各组换入相应含药血清：红背叶根水提物低剂量组，红背叶根水提物中剂量组，红背叶根水提物高剂量组，红背叶根醇提物低