两种兰花病毒的生物学特性与其抗血清的制备和应用

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1、独创性声明本人声明，所呈交的学位(毕业)论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中己作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位(毕业)论文作者亲笔签名：节仝炽日期：20订一。r一；D论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位(毕业)论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段

2、保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。白学位(毕业)论文作者亲笔签名：丫名}，b日期：二佃1一-F．≥．。⋯⋯躲坞骶旷嗍竹舡口f福建农林大学硕士学位论文摘要建兰花叶病毒(Cymbidiummosaicvirus，CyMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossumringspotvirus．ORSV)是兰花上最为重要的两种病毒，侵染兰花后可使兰花叶片、花型、花色受到不同程度的影响，造成兰花品质明显下降，商品价值大幅度降低。本研究利用传统方法和现代基因工程技术分别制各了这两种病毒的抗血清，对于加强兰花病毒的检测和控制，防止病毒病的发生和传播扩散具有重要意义。从漳州地区采集获得

3、具有典型病毒病症状的兰花样本，经ID-ELISA检测、电镜观察和生物学测定三种方法的诊断鉴定，证明样品不同程度地感染了CyMV和ORSV．使用卡特兰和建兰病叶分别提纯到6．4mg的CyMV和26．8mg的ORSV，并用于免疫家兔获得较为特异的抗血清，效价分别达到1：512000和l：256000。使用RT-PCR技术成功扩增到CyMV和ORSV福建漳州分离物外壳蛋白基因，并克隆到pMDl8．T载体上，双酶切重组质粒后，分别将目的片段插入表达载体pET-29a(+)。转化E．coliDHSa，筛选获得阳性重组表达质粒29a．CyMVCP和29a-ORSVCP，并测定插入的序列，分

4、析是否成功克隆目的基因，且确保在载体中没有发生移码突变。序列分析表明，插入的CyMV福建漳州分离物外壳蛋白基因的ORF长672bp，编码223aa，蛋白分子质量约为23．6KDa，核苷酸序列同已报道的新加坡分离物(AF405719．1)的同源性最高，为98．7％，而氨基酸序列同源性达97．8％；ORSV福建漳州分离物外壳蛋白基因的ORF长477bp，编码158aa，蛋白分子质量约为18．0KDa，核苷酸序列同已报道的中国广东分离物(AY360407)同源性最高，达到99．8％，仅一个碱基的差异，而氨基酸序列同源性达100％。重组表达质粒转化E．coliBL21(DE3)，加IP

5、TG诱导获得与预期大小一致的融合蛋白条带。CyMVcP融合蛋白和ORSVCP融合蛋白分别使用镍琼脂糖凝胶柱FF纯化和12％SDS．PAGE分离割胶回收，产物用于免疫家兔制各特异性抗血清．Westernblot鉴定结果表明所制备的抗血清与诱导表达的融合蛋白起特异性反应。由两种融合蛋白制备的抗血清效价均达到l：51200，工作浓度分别定为l：1000和1：1600，检测病汁液的灵敏度分别达到0．39mg／mL和0．1mg／mL，同TMV(Tobaccomosaicvirus)等11种病毒均无明显的血清学交叉反应，其中CyMVCP融合蛋白抗血清检测提纯病毒的灵敏度达到6．25x10一

6、mg／mL。福建农林大学硕士学位论文以上述由原核表达产物制备的抗血清抽样调查福建省兰花主产区蝴蝶兰病毒感染情况，各兰圃中CyMV感染率在。28．0％．67．7％之问，ORSV感染率在10．5％-60．0％之间，复合侵染率在6．8％．47．3％之间：合计324份样品中CyMV感染率占52．5％，ORSV感染率占42．6％，复合感染率占28．4％。关键词：建兰花叶病毒齿兰环斑病毒外壳蛋白原核表达抗血清．2·BiologicalandSerologicalPropertiesofTwoOrchidVirusesAbstractCymbidiummosaicvirus(CyMV)and

7、Odontoglossumringspotvirus(ORSV)arethetwomostprevalentandeconomicallyimportantvirusesinfectingorchids．Thcyinducetheleafandfloweroforchidgreatlydamaged，seriouslyaffectingitsqnalityandcommodityvalue：Inthisstudy，antiserumsspecificforthetwoorchidviruse