血浆exosomes小体对treg细胞功能的影响与b细胞体外扩增treg细胞的初步的研究

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1、复旦大学硕士研究生论文中文摘要目的：1．通过将人血浆Exosomes小体、重组Wnt分子分别与人外周血CD4+CD25+CDl27loW调节性T细胞(RegulatoryTCells，Treg)作用，观察Treg细胞在体外的存活情况及其Wnt信号通路的变化。2．通过将同种异基因人外周血B淋巴细胞体外扩增Treg细胞，观察Treg细胞扩增前后在数量上的变化及表型和功能是否改变，建立体外扩增Treg细胞的有效方法，并与树突细胞(dendriticcell，DC)扩增Treg细胞的方法相比较。方法：1．应用免疫磁珠分离方法分离纯化人外周血CD4+CD25+CDl

2、2710wTreg细胞，将Wnt分子和从多个健康供者血浆中分离得到的Exosomes小体分别加入到Treg细胞中，加入人白介素2(IL一2，50V／m1)。利用RT-PCR检测共培养12h后Wnt信号通路涉及的凋亡相关基因的改变，同时采用流式技术检测Wnt信号通路中磷酸化B—catenin水平的改变，并在共培养14天后采用流式技术检测各组细胞的凋亡情况。设立未经处理的Treg细胞组为对照组。2．将异体健康供者外周血分离得到的B淋巴细胞与磁珠分选得到的Treg细胞共孵育，用IL一2(100U／m1)和CD28单抗(500ng／m1)共同刺激，在培养14天的过

3、程中通过流式检测Treg细胞表型的变化，同时与树突状细胞扩增Treg细胞的方法相比较(培养条件相同)。14天培养结束后，将细胞与CFSE处理过的经强刺激(加入CD3单抗500ng／m1，IL-2300U／m1)的CD4+效应性T细胞共培养，在第五天通过流式检测Treg细胞对CD4+T细胞的增殖抑制，设立只经强刺激的CFSE处理过的CD4+T细胞为对照组。结果：1．通过RT—PCR分析纯化的Treg细胞上的Frizzled(FRZ)受体及低密度脂蛋白相关蛋白5(LRP5)和LRP6的基因表达，结果显示Treg细胞表达FRZ2、3、4，LRP6基因，通过Wes

4、ternBlotting技术检测血浆中Exosomes小体上Wnt3a和Wnt5a的蛋白表达，均有条带出现。共培养12h后，RT—PCR检测凋亡相关基因Bcl—xL、Bcl-2、c-Myc的表达，结果显示Treg细胞与血浆exosomes样小体或Wnt分子共培养时，抗凋亡基因Bcl-2相对于对照组均有明显的上调，另一抗凋亡基因Bcl-xL和诱导凋亡的基因c-Myc无明显变化。培养14天后，通过流式检测凋亡，加入Exosomes样小体或Wnt分子的Treg细胞生存率均比对照组高。复旦大学硕士研究生论文2．经B细胞联合IL一2和CD28单抗刺激的Treg细胞在

5、培养14天后流式检测Foxp3和CD4／CD25，阳性率均很高，此时计数Treg细胞为最初数量的20倍。利用CFSE检测技术，将扩增14天的Treg细胞与CD3单抗和IL一2强刺激的CD4+T细胞共培养，5天后流式检测，扩增后的Treg细胞能够有效地抑制CD4+T细胞的增殖功能。结论1．初步判断Wnt信号通路能够影响Treg细胞的生存状态，血浆Exosomes小体能够延长Treg细胞的生存时间，其中Exosomes小体携带Wnt分子与Treg细胞上的Frizzled受体作用可以活化Treg细胞的Wnt信号通路，在提高Treg细胞的生存率方面起了一定的作用，

6、即血浆Exosomes小体可能通过Wnt信号通路途径影响Treg细胞的存活。2．同种异基因B淋巴细胞能够在体外有效的扩增人外周血Treg细胞，扩增效率可达20倍以上，并且能显著抑制CD4+T细胞的增殖。关键词：CD4+CD25+CDl27low调节性T细胞，血浆Exosomes小体，Wnt信号通路，B淋巴细胞，体外扩增，增殖抑制中图分类号：R392．122复旦大学硕士研究生论文Abstract0bjective：1．Throughtheeffectofhumanplasmaexosomes-likevesiclesorrecombinantWntmolec

7、ulesonCD4-I-CD25-I-CDl27lowregulatoryTcells(Treg)，obsewedthesurvivalofTregcellsinvitroandthechangesoftheWntsignalingpathway．2．ThroughtheexpansionofTregcellsbyallogeneichumanperipheralbloodBlymphocytesinvitro，observedthechangesofTregcellsinthenumber，phenotypeandfunctionaftertheexpa

8、nsion，establishedaneffectivewayof