白眉蝮蛇去整合素adinbitor对肿瘤细胞的作用

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中刁i包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我～同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：，蔫·稚。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。_。。。。。。。‘。。。。‘。。‘。。。。。。一签字日期：丛年羔月羔日学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完

2、全了解大连医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借翅。本人授权大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，司+以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论丈。论文作者签名：指导教师签名：缝熊整签字日期：塑正年』月土日白眉蝮蛇去整合素Adinbitor对肿瘤细胞的作用硕士研究生：李楠指导教师：徐跃飞教授专业名称：生物化学与分子生物学摘要去整合素(disintegrins)是从蛇毒中提取的一类同源性很高的多肽

3、，含有Arg-Gly．Asp(RGD)序列或Lys．Gly．Asp(KGD)序列，半胱氮酸含量丰富，分子量为5～9kD[11。因为大部分细胞整合素(integfins)都能识别RGD序列，而大多数细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)蛋白成分都含有ROD序列，故去整合素可凭借其RGD识别序列而成为细胞外基质与细胞整合素间结合的强有力的竞争性拮抗剂，从而抑制整合索参与的多种生理活动。去整合素Adinbitor是由来自于中国旅顺的白眉蝮蛇又名短尾蝮(Gloydiusbrevicaudus)，学名为Ag

4、kistrodonhalysbrevicaudusstejneger的蛇毒中克隆得到的。Adinbitor由73个氨基酸残基组成，含有12个半胱氨酸残基和1个去整合素特征性RGD三肽识别序列，相对分子量为9kD，为去整合素家族的新成员，故可作为多种整合素受体的强有力的拮抗剂，具有抑制肿瘤的作用。肿瘤的发生是一个多因素、多阶段的长期复杂的过程，其细胞信号传递系统出现了明显的缺陷，整合素作为信号传导者发挥着重要作用。研究证明不同的整合素成员在肿瘤细胞内的表达水平有差异，在肿瘤发生的不同阶段表现为截然不同的作用，表明整合素可

5、通过传递特定的信号或诱导基因表达来调控肿瘤细胞的粘附、增殖、浸润和转移、凋亡以及肿瘤血管的生成等事件。而所有的去整合素都具有其生物学活性所必需的RGD特异性识别序列，凭借此序列去整合素可作为多种整合素受体的强有力的拮抗剂，抑制整合素在肿瘤发生过程中的各种作用。已经发现去整合素能够抑制肿瘤细胞对纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白和胶原的粘附，从而抑制肿瘤细胞的生长、浸润和转移，同时去整合素还具有诱导肿瘤细胞发生凋亡的特异作用。鉴于此，本论文将冻存的新鲜阳性表达菌E．coliBL2l，即其己完成带有组氨酸标签的重组质粒pET2

6、3b—adinbitor的转化和鉴定，进行复苏和IPTG的诱导表达，得到重组蛋白Adinbitor的可溶性高效表达，经组氨酸亲和层析柱纯化，获得了分子量为9kD的去整合素Adinbitor，从而在去整合素Adinbitor对人胃癌细胞MGC803的增殖、凋亡、粘附、浸润和转移方面进行研究。去整合紊Adinbitor对人胃癌细胞MGC803增殖影响的实验采用MTT比色法，结果表明，Adinbitor可呈剂量依赖性方式抑制MGC803细胞的增殖，其抑制MGC803细胞增殖的IDs0为3．529raol／L。在其诱导MGC8

7、03细胞凋亡实验中，采用相差显微镜直接观察和苏木精．伊红(HE)染色进行观察，结果显示出细胞凋亡的典型的形态学特征如胞间连丝消失，细胞皱缩成团，胞内出现空泡等现象，而且随Adinbitor浓度的增加而越发明显。进～步采用Hoechst染色也可检测到Adinbitor具有诱导MGC803细胞发生凋亡的功能，在荧光显微镜下经紫外光激发，凋亡的细胞核发出耀眼的蓝光，细胞明显皱缩成团，并且随Adinbitor浓度的增加，凋亡越发明显；而未经Adinbitor处理的细胞染色淡且均匀，呈均匀分布。接下来的Adinbitor对MGC

8、803细胞的粘附抑制实验，结果为Adinbitor对MGC803细胞粘附于纤连蛋白(fibroneetin，FN)具有明显的抑制作用，3．59mot／L浓度的Adinbitor对MGC803细胞粘附于FN(2h)的抑制率约为44％；对粘附于人工基底膜基质Matrigel也同样具有明显的抑制作用，且呈剂量依赖性。其后的转移抑制实验中