cd133阳性2f阴性肺癌细胞的分选、鉴定与差异基因的筛选

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1、CD133阳性、CD133阴性肺癌细胞的分选、鉴定及差异基因的筛选CD133阳性/阴性肺癌细胞的分选、鉴定及差异基因的筛选中文摘要研究背景与目的肿瘤耐药、转移和复发是恶性肿瘤临床治疗失败及患者死亡的主要原因，寻找耐药和转移的相关基因是阐明肿瘤耐药和转移机制，解决肿瘤临床治疗的关键。本研究拟利用肿瘤干细胞表面标记物——CD133，通过磁式分选的方法对肺癌细胞株中的CD133阳性细胞及CD133阴性细胞进行分选，并对其生物学特性进行鉴定。在此基础上，利用转移和耐药两种基因芯片对CD133阳性/阴性细胞进行对比检测，筛选转移、耐药的差异基因，旨在为肿瘤转移、耐药

2、机制的研究提供新线索，为肺癌的基因治疗提供新靶点。方法一、免疫组化方法检测81例肺癌石蜡包埋组织及10例正常肺组织中CD133的表达，观察CD133在组织中表达和分布情况；统计分析CD133表达与肿瘤组织学类型、肿瘤分级、临床分期的关系。免疫细胞化学方法检测CD133在人肺腺癌细胞株A549中的表达。二、分别采用阳性分选柱（MS柱）和阴性分选柱（LD柱）通过磁式分选的方法对人肺腺癌A549细胞株中CD133阳性细胞、CD133阴性细胞进行分选，并用免疫荧光染色法对分选细胞进行细胞纯度鉴定。三、CD133阳性细胞及CD133阴性细胞分别在不含血清的DMEM-

3、F12培养液（含EGF、bFGF）中进行体外培养，观察生长情况及“sphere”形成情况。四、平板克隆形成实验检测CD133阳性细胞、CD133阴性细胞及未分选细胞克隆形成率，比较三者的增殖能力。五、取形成“sphere”的CD133阳性细胞加入含10%胎牛血清的DMEM-F12培基（不含bFGF、EGF）进行体外诱导分化培养，观察诱导分化前后细胞的形态差异；免疫细胞化学方法检测诱导分化前后细胞CD133、CK7的表达情况。六、采用SuperArray第二代功能分类基因芯片对CD133阳性细胞及CD133阴性细胞分别进行肿瘤转移基因（84个转移相关基因）、

4、耐药基因（84个耐药相3CD133阳性、CD133阴性肺癌细胞的分选、鉴定及差异基因的筛选关基因）的对比检测，结合生物信息学技术分析两组之间的差异基因。结果一、肺癌组织中CD133阳性肿瘤细胞呈分散或小灶状/巢状分布于癌巢边缘，数量稀少。81例肺癌标本CD133表达阳性率为53.1%（43/81），CD133表达与各组织学类型的关系分析显示：鳞癌、腺癌及其他类型阳性率分别为48.3%（14/29）、52.9%（18/34）和61.1%（11/18），CD133的表达与组织学类型无关（P>0.05），与肿瘤分级及临床分期无关（P>0.05）。10例正常肺组织

5、中均未见CD133阳性细胞。二、免疫细胞化学染色结果显示：人肺腺癌A549细胞株中有CD133阳性细胞存在，数量稀少。三、通过阳性分选柱（MS柱）从人肺腺癌A549细胞株中分选出的CD133阳性细胞率约为0.2%。四、免疫荧光染色CD133阳性细胞发红色荧光。经MS柱分选的CD133阳性细胞中绝大部分细胞发红光荧光；经LD柱分选的CD133阴性细胞中仅见少量细胞发微弱的红色荧光，表明磁式分选所获得细胞纯度较高。五、分选细胞培养可见，CD133阴性细胞组培养24小时见部分细胞呈贴壁生长，CD133阳性细胞组虽有细胞贴壁，但数量明显少于CD133阴性细胞组。两

6、组贴壁生长的细胞培养8周全部死亡。CD133阳性细胞组培养过程中大多数细胞呈悬浮生长状态，持续可见少量细胞贴壁，于培养第9天出现“sphere”；CD133阴性细胞组悬浮细胞培养8周未见“sphere”形成。六、平板克隆形成实验可见CD133阳性细胞、CD133阴性细胞、未分选细胞组平均克隆形成率分别为57.1%、3.3%、8.7%，三组间克隆形成率差异有统计学意义（P<0.05）。七、血清诱导分化的CD133阳性细胞免疫细胞化学染色结果显示：诱导分化前细胞CD133阳性、CK7阴性；诱导分化后细胞CD133阴性、CK7阳性。八、基因芯片检测结果显示：与C

7、D133阴性组相比，CD133阳性组84个耐药基因中表达水平降低达两倍或以上的有30个，差异最高达8.9倍，表达水平升高的1个，差异为2.5倍；84个转移基因中表达水平降低达两倍或以上的有19个，差异最高达12倍。4CD133阳性、CD133阴性肺癌细胞的分选、鉴定及差异基因的筛选结论一、人肺癌组织中有CD133阳性细胞，数量稀少，呈小灶状分布。CD133的表达水平与肿瘤组织学类型、肿瘤分级、临床分期无关。二、采用磁式分选的方法成功从人肺腺癌A549细胞株中分选出CD133阳性和CD133阴性细胞。三、体外实验证实CD133阳性细胞能在无血清培基中生长并形

8、成“sphere”，可在体外诱导分化，具有高增殖潜能，提示CD13