阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者氧化应激相关因子的临床分析

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1、2材料与方法1．1研究对象第一章材料与方法2010年1月至2010年7月因打鼾到我院就诊，并行多导睡眠检测确诊为OSAHS患者60例，其中男52例，女8例，平均年龄41．48士8．77岁，诊断标准参照2002年中华医学会耳鼻咽喉科分会杭州会议OSAHS诊断标准Ⅲ，即根据患者通常有白天嗜睡、睡眠时严重打鼾和反复的呼吸暂停现象，检查有上气道狭窄因素，经多导睡眠监测检查每夜7个小时睡眠过程中呼吸暂停及低通气反复发作30次以上，或睡眠呼吸暂停和低通气指数(apnea-hypopneaindex，AHI)大于或等于5次／h，呼吸暂停以阻塞性为主的标准，诊断为OSAHS；并根据AHI将患者

2、分为轻度OSAHS组(5～20次／h)10例，中度OSAHS组(21"--40次／h)15例，重度OSAHS组(>40次／h)35例。正常对照组为我院健康体检者26例，其中男21例，女5例，平均年龄42．5±8．14岁，所有入选者经询问病史及进行相关的检查，排除慢性呼吸系统疾病、肝肾疾病、心血管疾病、糖尿病、甲状腺功能亢进或减低、血红蛋白病、急慢性感染性疾病、恶性肿瘤及结缔组织疾病等。1．2研究方法1．2．1试验仪器及试剂多导睡眠仪(美国邦德公司)，离心机，-80冰箱，恒温箱，酶标仪，人一氧化氮定量检测试剂盒(96孔，青岛瑞德公司)，人一氧化氮合酶定量检测试剂盒(96孔，青岛瑞

3、德公司)，人血管内皮生长因子定量检测试剂盒(96孔，青岛瑞德公司)，人低氧诱导因子-la定量检测试剂盒(96孔，青岛瑞德公司)，人氧化低密度脂蛋白定量检测试剂盒(96孔，青岛瑞德公司)。1．2．2临床资料所有研究对象在监测当日不睡午觉，禁饮酒及咖啡，停用镇静剂，来医院后休息30分钟，记录年龄、性别、测量身高、体重并计算体重指数。1．2．3多导睡眠图(PSG)监测实验组所有对象均接受整夜多导睡眠监测，监测前24h禁酒、茶、．咖啡、烟3青岛大学硕士学位论文药物等影响睡眠、呼吸及心率(律)的因素，记录口鼻气流、胸腹呼吸、体位及声、脑电图及最低血氧饱和度(LSaO。)等，结果经计算机分

4、析并人工校正后得睡眠呼吸暂停低通气指数(AHI)和最低血氧饱和度(LSaO：)等数据。2．4标本的采集PSG监测结束后(次日清晨)，空腹经肘静脉抽取静脉血3mL，经处理后离心，离血清，置-80"C冰箱保存备用。对照组经询问病史后空腹经肘静脉抽取静脉3mL，经处理后离心，分离血清，置-80"C冰箱保存备用。2．5标本的检测1)血清N0定量检测：1)人一氧化氮(NO)定量检测试剂盒(96孔)(青岛瑞德公司)。2)原理：采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)。将标准品、待测样本加入到预先包被人一氧化氮(N0)单克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再

5、加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物(TMB)在辣根过氧化物酶(HRP)催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中人一氧化氮(N0)浓度呈正相关，450nm波长下测定oD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中人一氧化氮(NO)含量。3)方法：a)提前30分钟从冰箱中取出试剂盒及待测血清样本平衡至室温。b)将浓缩洗涤液用蒸馏水稀释。C)将不同浓度标准品(200、100、50、25、12．5、6．25

6、lmol／L)加入标准孔50

7、lL；待测样本孔加入待测样本10uL，再加稀释液40pL；空白孔不加。d)37℃恒温箱温

8、育30min。e)洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置lmin，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，洗板4次。f)每孔加入酶标工作液50pL，空白对照孔不加。g)37"C恒温箱温育30min。h)洗板4次．i)先加入显色剂A液50llL，再加入显色剂B液50uL，用手轻轻震荡混匀30s，37℃避光显色15min。加终止液50uL，终止反应，混匀4材料与方法后即刻用450nm波长测量各孔的OD值。j)以标准品的浓度作横坐标，0D值做纵坐标绘制标准曲线，通过标本的OD值查出其浓度，最终浓度乘于5。(2)血清NOS定量检测1)人一氧化氮合酶(NOS)定量检测试剂盒(96孔)(青岛

9、瑞德公司)。2)原理：采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)，将标准品、待测样本加入到预先包被人一氧化氮合成酶(NOS)单克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物(TMB)在辣根过氧化物酶(HRP)催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中人一氧化氮合成酶(NOS)浓度呈正相关，450nm波长下测定0D值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中人一氧化氮合成酶(N