热休克转录因子4基因突变致先天性白内障分子机理研究

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1、河南大学2010届博士研究生学位论文中文摘要背景热休克转录因子4(heatshocktranscriptionfactor4，Hsf4)被认为是一种新的与白内障发生相关基因，在Hsf4DNA结合域或其它调节域的错义突变与人先天性或家族常染色体显性或隐性遗传性白内障密切相关，这些基因突变与动物先天性白内障发生也密切相关，小鼠模型中Hsf4基因缺失可妨碍晶状体上皮细胞增殖和纤维细胞终未分化，从而导致出生后晶状体核白内障。Hsf4有Hsf4a、Hsf4b两种亚型，Hsf4b是调节鼠晶状体发育中唯一亚型，已报道Hsf4b基因缺失不仅可以下调许多热休克蛋白(例如：Hsp257-晶体蛋白，P

2、-晶体蛋白和骨骼肌蛋白)的表达，而且可以上调鼠晶状体组织中许多基因的表达(例如：FGF家族成员)，这些研究表明Hsf4b通过对其下游靶基因转录激活和转录抑制双重作用而调控晶状体发育，但是，调节Hsf4b转录活性的信号通路还不清楚。目的探讨Hsf4调控晶状体发育的分子机制。通过探究Hsf4在上述信号转导通路中的作用，揭示Hsf4基因突变所致先天性白内障的致病机理，为早期诊断和治疗Hsf4突变相关的先天性白内障提供理论依据。方法用人心脏cDNA文库为模板，应用囊括Hsf4b全长的引物进行PCR并在Hsf4bcDNA的N一端加入Flag标签。将PCR产物经Kpnl和EcoRl酶切后，与

3、该二酶线性化pcDNA3．0质粒一起连接获得重组质粒pcDNA—Flag—Hsf4b，将克隆好的pcDNA-flag-Hsf4b转染HEK293T细胞，并用抗Flag抗体进行免疫印迹分热休克转录因子4基因突变致先天性白内障分子机理研究析，免疫沉淀实验和体内Pulldown实验证明Hsf4b可与MAP激酶P38结合，激酶实验结果显示P38可体外磷酸化Hsf4b。用Hsf4．／．小鼠的晶状体上皮细胞转染SV40，T-抗原，G418筛选建立永生化细胞系MLEC／Hsf4-／-。应用不同的含有CMV启动予的质粒(如腺病毒载体)，在mLEC细胞和其他细胞系中表达Hsf4b，测定Hsf4b对

4、CMV启动子的抑制作用。DNA．蛋白沉淀实验和DNA．蛋白结合实验体外测定Hsf4b与CMV启动予的结合。免疫印迹检测Hsf4b／S299磷酸化抑制Hsf4b的转录活性，免疫沉淀和细胞内GSTpulldown实验证明Hsf4蛋白可以结合转录抑制调节因子Daxx，免疫荧光染色实验发现Hsf4b被摹集到核内Daxx的POD核小体内。仕甲：口木成功构建热休克转录因子4b(Hsf4b)[拘真核表达载体并在真核细胞HEK293T中表达，研究发现Hsf4b可与MAP激酶P38结合，Hsf4b的C．端转录调控区参与和P38的结合，P38可体外磷酸化Hsf4b。Hsf4b具有转录抑制功能，Hsf

5、4b可与CMV启动子中176bp处TTC(HSE序列)的序列直接结合，抑制CMV启动子活性，把此序列中TTC突变为GCC可抑制Hsf4b对CMV活性的负性调节作用。Hsf4b转录抑制功能通过与转录抑制调节因子Daxx结合实现，Hsf4b被摹集到核内Daxx的POD核小体内，Hsf4b与Daxx的结合受Hsf4b／S299磷酸化调控。结论实验首次证明Hsf4b与P38结合而被磷酸化，并且发现Hsf4b具有转录抑制功能，Hsf4b／S299磷酸化可调控Hsf4b与Daxx结合从而调控Hsf4b转录抑制活性。为进一步探讨Hsf4b在晶状体发育过程中的作用提供了新的信号通路。关键词：热休

6、克转录因子4；先天性白内障；MAPKs；Daxx，CMV启动子和Hsp25II河南大学2010届博士研究生学位论文BackgroundAbstractTheheatshockfactor4hasbeenidentifiedasanovelcataractrelatedgene．Multiplemissense—mutationsintheHsf4DNAbindingdomainorinotherregulatoryregionshavebeenlinkedtohumancongenitalorfamilyinheritingchromosomeautosomeorrecessiv

7、ecataracts．Thesemutationsalealsoassociatedwiththeoccurrenceofanimalcongenitalcataracts．Inmousemodel，deletionoftheHsf4geneinducesnucleatedcataractofpostnatallensbyinterferingwithbothlensepithelialcellproliferationandfibercellterminaldifferenti