番茄madsbox转录因子slfyfl调控衰老和果实成熟的分子机理研究 (1)

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1、番茄MADS-box转录因子SlFYFL调控衰老和果实成熟的分子机理研究重庆大学博士学位论文学生姓名：解巧利指导教师：陈国平教授专业：植物学学科门类：理学重庆大学生物工程学院二O一四年十月万方数据万方数据MolecularmechanismofMADS-boxtranscriptionfactorSlFYFLregulatingsenescenceandfruitripeningintomatoAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDoctor’sDegre

2、eofScienceByQiaoliXieSupervisedbyProf.ChenGuopingSpecialty:BotanyBioengineeringCollegeofChongqingUniversity,Chongqing,ChinaOctober2014万方数据万方数据中文摘要摘要MADS-box蛋白是一类广泛存在于真核生物中的转录因子家族。在高等植物中MADS-box蛋白主要在果实成熟、脱落，器官衰老及花器官的形成等生长发育过程中发挥作用。2002年，通过图位克隆法，Vrebalov等找到了MADS-box家族转录因子SlMADS-RIN，并证明其为影响番茄果

3、实成熟的关键转录因子，且作用于乙烯合成途径。为进一步分析番茄MADS-box家族中其他未知基因的功能，本研究通过生物信息学分析，分离和克隆到一个与拟南芥MADS-box蛋白AtFYF（AtAGL42）直系同源且与SlMADS-RIN蛋白相似度较高的番茄SlFYF-Like(SlMBP18)蛋白，并登录到了NCBI数据库（GenBank登录号：KF709444）。利用实时荧光定量PCR对SlFYFL基因的表达模式分析发现，SlFYFL基因在番茄叶片，果实，果柄离区和萼片中大量表达，表明该基因可能与叶片发育，果实成熟及脱落等生长发育关系密切。为进一步探索和分析该基因的生理学功能及

4、其作用机理，我们分别构建了SlFYFL基因的超表达和RNAi沉默载体，通过农杆菌介导法将其分别成功转入野生型番茄中，并培育出SlFYFL超表达及沉默的转基因番茄株系。对SlFYFL超表达及沉默转基因番茄株系的研究结果表明：1.SlFYFL基因可能通过参与调控乙烯相关基因的表达而调节番茄叶片叶绿素的含量来调控番茄叶片的衰老程度。超表达SlFYFL基因的番茄叶片衰老推迟，叶绿素含量升高，光合作用相关基因（Slcab7和SlrbcS）表达明显上调，乙烯合成相关基因（ACO1、ACO3、ACS1A、ACS2和ACS6）表达显著降低，而沉默转基因番茄叶片则表现出与超表达转基因番茄叶片相

5、反的表型；2.SlFYFL基因可能通过参与调控乙烯相关基因的表达而调节番茄果实的成熟。超表达SlFYFL基因的转基因番茄果实成熟时间推迟，类胡萝卜素积累量降低，贮藏时间变长，果实硬度增加，乙烯合成量降低，而沉默转基因株系果实的系列指标与超表达转基因株系果实相反。果实成熟相关基因，类胡萝卜素合成基因（SlPSY1，SlPDS及SlZDS），细胞壁代谢基因（SlPG、SlEXP1、SlXTH5及SlTBG4）和脂肪酸代谢基因（SlTomLoxA，SlTomLoxB及SlTomLoxC）的表达在超表达转基因果实中受到明显抑制，而在沉默转基因果实中显著上调；乙烯合成相关基因（RIN、

6、ACS2、ACO1及ACO3）及乙烯响应基因（E4和E8）在沉默转基因果实中显著上调，而在超表达转基因果实中受到明显抑制。果实硬度测定结果表明，超表达转基因果实的硬度明显大于野生型同时期的果实而沉默转基因果实的硬度较野生型的明显降低。耐贮藏实验发现，超表达转基因果实的贮藏时间明显长于野生型番茄，而沉默转基因番茄的贮藏时间比野生型显著缩短。果实乙烯含量测定显示，超表达转基因果实的乙烯合成量仅为野生型的40%-50%，I万方数据重庆大学博士学位论文而沉默转基因果实的乙烯合成量比野生型果实高3.5倍以上，表明SlFYFL可能在乙烯上游发挥作用而调控番茄果实的成熟；3.SlFYFL参

7、与了乙烯相关的离区发育过程。表型观察发现，超表达SlFYFL基因的转基因番茄果实脱落推迟，而沉默转基因番茄果实脱落提前。显微镜观察结果显示，果柄离区中离层细胞的形成在超表达转基因番茄果柄离区中的发育推迟而在沉默转基因番茄果柄离区中显著提前。断裂力度测试发现，拉断超表达转基因果柄离区所需断裂力度相比野生型增大，拉断沉默转基因果柄离区所需断裂力度相比野生型减小。实时荧光定量PCR结果发现，离区发育相关基因（SlMADS-MC、JOINTLESS、Bl、WUS、Ls及GOB）的表达在超表达转基因株系的果柄离区