食管癌线粒体dna微卫星不稳定性的分析

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1、第三军医大学硕士学位论文食管癌线粒体DNA微卫星不稳定性研究刚蟊食管癌(Esophagealcancer，EC)占我国恶性肿瘤死亡的第2位，世界上70％的食管癌发生在我国。由于目前的治疗效果不佳、发病机理尚不完全清楚，对此进行深入研究，不断探索新的诊断、防治途径，是十分必要的。肿瘤分子遗传学研究表明，一个正常细胞逐步获得恶性表型需要多个遗传改变的积累。一类是瘸基因的激活、抑癌基因的失活和细胞调亡相关基因异常等；另一类是近来发现的基因不稳(genomeinstabili．ty，GI)，认为它是肿瘤发生的一种新的机制。基因不稳可

2、分为：即染色体不稳(Chromosomeinstability)，亦称肿瘤抑制途径：另一为微卫星不稳定性(microsatelliteinstability，MSI)⋯，也称MSI途径。在前者，包括低MSI和MSI阴性的肿瘤，APc／MCc、DCC和p53基因等抑癌基因的缺失和突变在其发生和发展中起重要作用；而在后者，由于DNA错配修复基因表达或调控异常，使单核苷酸水平突变率增加，微卫星DNA序列发生改变，导致广泛的MSI，以致整个基因组不稳定，基因组随机突变率增高，有可能增加某些靶基因编码区中重复序列的突变率的改变，而编码

3、区微卫星改变能使基因发生移码突变产生截短蛋白，导致靶基因的失活”“。如肿瘤相关基因TGF．13IIR、IGFIIR、BAX、hMSH3和hMSH6基因的移码突变，突变细胞就可能获得某种生长优势而恶化“。。食管癌的发生主要涉及肿瘤抑制途径”’，而微卫星不稳途径这方面的研究国内外少有报道。MSI包括细胞核MSI(nMSI)和线粒体MSI(mtMSI)。近年研究发现，线粒体MSI在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。线粒体是细胞独特而重要的细胞器，线粒体DNA(mtDNA)独立于细胞核DNA之外，能独立进行复制、转录和翻译，具有非常活

4、跃的自我复制能力。由于真核细胞线粒体DNA几乎均是小于20kb的闭环分子，与核基因组相比，其分子量小，缺乏组蛋白保护，且其缺乏损伤修复系统。此外，人体内90％以上的氧直接经线粒体的电子传递体系一呼吸链传递，因此mtDNA比核基因组更易受氧化性损伤和致癌物的攻击LCJ。象核DNAMSI可引起肿瘤相关基因突变一样，线粒体MSI倾向于有mtDNA基因组内的微卫星不稳定性或突变改变”’；线粒体受损以后可通过改变细胞能量产生，提高线粒体氧化压力．引起线粒体酶表达异常和／或调控凋亡等途径。影响细胞的生物学行为。⋯1。研究发现，胃癌”3、

5、结直肠癌⋯1“、乳腺癌”4。等mtMSI是一种非常常见的现象，认为mtMSI可能在这些肿瘤的发生中起重要作用。关于线粒体DNA微卫星不稳在食管癌发生中的作用，以及它与核DNA微卫星不稳的关系，国内外尚未见报道。对此进第三军医大学硕士学位论文行深入研究，对于进一步阐明食管癌的分子发病机理可能有重要意义。本研究采用PCR—SSCP为基础的方法，检测了食管癌组织mtMSI和nwISI，希翼了解其在食管癌发生中的作用，从新的角度揭示食管癌的发病机理，为食管癌的诊断、防治探索新的途径。材料和方法一、病例资料收集本院2002年6-10月

6、手术切除的食管鳞状细胞癌、癌旁组织及切正常缘组织45例，男性28例，女性17例，年龄51～72岁，平均年龄(58．45±5．27)岁。分化程度：高分化14例(34．2％)，中分化19例(42．1％)，低分化12例(23．7％)。按UICC(1997)TNM分期：T2NOMO2例(5．3％)，T3NOMO13例(29．o％)，T2NIMO5例(10．5％)，T3NIMO22例(47．4％)，T4N—M02例(5．3％)，T-N—M11例(2．6％)。肿瘤组织在原发灶取材，避开坏死、炎症区域；癌旁组织取自肿块旁2．0crn组织：

7、正常组织取自距肿块边缘5．0cm以上的切缘食管组织。各病例手术前均未接受放疗或化疗。标本取出后立即置液氮保存备用。食管癌、癌旁及正常食管组织显微镜下观察，证实食管癌组织中肿瘤细胞占7096以上，正常组织中无肿瘤细胞。二、主要仪器台式高速离心机：中科院武汉科学仪器厂DU一640紫外分光光度计：USADNA扩增仪2400：USA垂直电泳装置：Bio—Rad公司，USADYY—III一5型稳压稳流电泳仪：北京．凝胶呈像仪：Bio-Rad公司。USA一80℃超低温冰箱：USA一20℃低温冰箱：国产电子天平：中国上海仪器厂恒温水浴箱：

8、国产高压蒸汽消毒锅：国产恒温干燥箱：四川成都MRl812型台式高速低温离心机：Jouan公司，USA三、基因组DNA的提取(--)试剂2第三军医大学硕士学位论文1．TBE缓冲液：lOmmol／LTrislOmmol／LNa，EDTA(乙二胺四乙酸二钠)t50mmol／LNaEl调整pH值为