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1、胃癌患者微卫星不稳定性发生和DNA倍体的关系朱少俊,金洲祥,王继生,徐鲁白(325027温州,温州医学院附属第二医院普通外科)微卫星不稳定性(microsatelliteinstability,MSI)作为表征基因组不稳定性的一个指标,具有[1-2]判断预后和指导治疗的重要临床价值。但MSI在胃癌中发生率研究报道尚不一致，我们既[3]往通过对胃癌患者胃液的检测已经发现MSI在胃癌胃液中有较高阳性率，且与预后相关，为了进一步比较胃癌组织与胃液组织中MSI阳性表达率，我们对60例患者胃癌组织MSI两位点和DNA倍体类型进行了检测，并探讨其与胃癌临床病理参数、DAN倍体类型之间的关系。资料
2、与方法一、临床资料收集2003年11月～2006年11月60例经手术确诊的胃癌患者，术前未接受化疗或放射治疗。其中男性42例，女性18例，平均年龄（59±12）岁。二、MSI的检测MSI的检测采用聚合酶链反应K单链构像多态性分析（PCR-SSCP）方法检测各位点重复序列改变，具体步骤如下:(1)DNA的提取：切取胃癌及相对应胃切端肿瘤细胞阴性的石蜡包埋组织6-10片，厚6μm。酚-氯仿-异戊醇法提DNA。选用D17S250、D2S123两个微卫星位点，D17S250引物序列：上游5’-GGAAGAATCAAATAGACAA-3’,下游5’-GCTGGCCATATATATATTTAAA
3、CC-3’,150bp;D2S123引物序列：上游5’-AAACAGGATGCCTGCCTTTA-3’,下游5’-GGACTTTCCACCTATGGGAC-3’,197bp。引物序列由上海生工合成，扩增条件采用美国2400型PCR扩增仪扩增，PCR反应体系为50mmol/lKC1，10mmol/LTRIS-HCL，0.1％TritoX-100，1.5mmol/LMgC12，200umol／LdNTPS，模板DNA200ng，上下游引物各50pmol/L，Taq酶1U，加去离子水至50ul。PCR反应条件为：94℃30S，53℃～57℃30S，72℃30S，共35个循环，最后72℃延伸
4、10min，1．5％琼脂糖凝胶检测PCR产物，证实为无杂带。(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳：取上述PCR产物10ul加入10ul变性剂(含95％去离子甲酰胺、10mmolEDTA，Ph8．0、0．5％二甲苯青、0．02％溴酚资金项目：温州市科技发展项目资助（S2002A032）通信作者：金洲祥，E-mail:jzx0847＠sina.com.cn联系电话：135662637901PDF文件使用"pdfFactory"试用版本创建www.fineprint.cn蓝)，30ul石蜡油，煮沸5min，取出立即冰浴2min以上，再将水相全部上样于8％非变性聚丙烯酰胺凝胶板(含5％甘油，丙烯酰胺与亚
5、甲基双丙烯酰胺之比为29：1)上。开始在600V电压下电泳50min，电泳后的凝胶用10%的乙酸和1.13%的硝酸(固定液)处理5min,水冲洗2～3次,再用12mol/L的硝酸银(染色液)染2次,每次10min,水冲洗3次,最后用3%碳酸钠-0.0515%甲醛(显色液)显色约5min,至带型清楚而背景不过高为止。肿瘤组织、癌周组织和对应正常组织DNA在同一条件下进行PCR扩增，电泳，银染。(3)结果判定：结果分析与正常组织比较，胃癌条带出现增多，丢失或移位，则MSI阳性。如果出现完全一致的电泳条带，则MSI阴性(MSS)。三、流式细胞仪检测(flowcytometry,FCM)DN
6、A倍体类型将组织经机械法制成单细胞悬液,95%冷乙醇固定,碘化丙啶染色,在流式细胞仪上进行检测,测样前用正常人外周血校准仪器,使其CV值小于3%,分析采用ModFit细胞周期软件。以[4]样本中二倍体细胞DNA含量作为内标,按照1998年欧洲分析细胞病理学协会推荐的标准,计算肿瘤细胞的DNA指数(DNAindex,DI):DI=肿瘤细胞的G0/1峰均道值/正常细胞的G0/1峰均道值。根据DI将样本分为二倍体(DI=1)和异倍体(DI≠1)两种倍体类型。四、统计学分析2MSI检出率比较采用x检验或Fish检验，两组间均数的比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学义。结果一、胃癌MS
7、I检出率分析2个位点，60例胃癌患者共检出MSI阳性17例，总阳性率为28.3%(17/60),D17S250和D2S123阳性率分别为10/60(16.7%)和15/60(25%),8例患者为D17S250和D2S123均阳性，见图1。二、MSI与临床病理参数之间的关系具体见表1，分析结果表明:MSI的发生和胃癌分化程度、HP感染、TNM分期和淋巴结有移相关(P<0.05),而与性别、年龄、肿块部位及Lauren分型无关,MSI阳性患者往往分化程度高,T
