人参果和三七提取物对大鼠ami后缺血心肌血管生成和体外培养huvec的影响

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1、论文一细胞实验三七和人参果提取物对HUVEC增殖，VEGF分泌和VEGFmRNA表达的影响实验一人脐静脉内皮细胞的分离、培养和鉴定内皮细胞为血管内表面一层完整的单层细胞，介于血流与血管壁组织之间。它不仅是一机械屏障，还具有物质转运、自分泌、旁分泌等功能，并调节血管、组织和器官的病理生理过程。在血管新生的过程中，内皮细胞不仅参与整个过程，而且也是重要的靶细胞。因此，研究各种因素对内皮细胞的干预影响，也就成为了研究血管新生过程的一个重要方法。而血管内皮细胞培养是体外研究人体血管内皮功能的重要手段，人脐静脉(HUV)是它的常用来源。因为

2、HUV在某些方面具有与动脉生物学特征相似的优点，因此用HUVEC培养来测得与血管新生相关的各项指标。为研究三七和人参果提取物对血管生成的细胞和分子调控机制提供了根本的条件。1实验材料1．1实验材料来源：健康产妇的胎儿脐带，约20-30cm，由北京市海淀区妇幼保健医院提供。1．2主要试剂及试剂盒胶原酶I(collagenaseI型)、表皮生长因子(EGF)：Sigma公司DMEM培养基：GIBCO公司胎牛血清：Hyclone公司兔抗人VIII因子相关抗原一抗、生物素标记的抗兔IgG二抗、山羊血清、sP免疫组化染色试剂盒、浓缩型DAB

3、试剂盒：均购自北京中山生物技术有限公司链霉素抗生物素蛋白一过氧化物酶：Vector公司1．3主要仪器二氧化碳恒温孵育箱：美国REVCO．R．荧光倒置相差显微镜：德国Leica超净工作台：北京昌平长城空气净化工程公司2实验方法2．1HUVEC的分离与培养2．1．1HUVEC的分离取健康产妇的婴儿脐带约30cm左右，在超净工作台内，用D-Hank’s液冲洗脐静脉内残血及血栓，反复冲洗至血尽。吸取0．1％胶原酶I注入脐静脉，消化15min。吸出含内皮细胞(Ec)的消化液，注入两支离心管，再吸取20-30mlD-Hank’s液冲洗脐静脉，

4、以获取更多的Ec，并注入离心管。1500r／min(rpm)离心5min，小心弃去上清液，保留底部细胞液。再加入裸DMEM液，1500rpm离心5min，小心弃去上清液，保留底部细胞液。加入全EIMEM培养液，吹打混匀。取少许细胞用台盼蓝拒染法检测细胞存活率>95％，并进行细胞计数，以104-105个／ml将Ec悬液接种于包被好的T：s培养瓶中，置培养箱(37℃、5％CO：、100％湿度)培养，观察细胞生长情况，待细胞充分贴壁后，进行换液。2，1．2HUVEC的换液小心将培养瓶内培养液吸出，加入PBS清洗2次，再加入金DMEM培养

5、液，置培养箱继续培养，2-3天换液一次，观察细胞生长情况，3-5天后细胞连成片，说明细胞已融合。2．1．3HUVEC的传代培养Ec生长成单层后，吸去培养液，用PBS冲洗一次，加入0．25％胰酶，消化1o一30秒，镜下观察Ec离壁变圆后，立即加入等体积的5％血清PBS终止消化，吹打成EC悬液，移入离心管，1500rpm离心5min后，弃去上清，加入全DMEM培养液，吹打成Ec悬液。将Ec悬液接种于2只包被好的T：，培养瓶中(1：2)，分瓶传代培养，当EC传代培养至3—4代时，即用于实验。2．2HUVEC的鉴定2．2．1形态学鉴定用荧

6、光倒置相差显微镜进行HUVEC的形态学鉴定。一9．2．2．2免疫细胞化学方法鉴定实验用培养的人脐静脉血管内皮细胞(4代)，加入第一抗体和第二抗体；阴性对照所用细胞与实验组相同，但不加入第一抗体。将细胞接种至35mm塑料培养皿上，继续培养待细胞贴壁后，用PBS冲洗2次，5min／次。用95％乙醇固定15min，加入新配置的3％Hz02，3Omin。去上清，用PBS冲洗3次，5min／次。10％山羊血清室温下封闭15mill，倾去血清，加入1：50稀释的兔抗人VIII因子相关抗原抗体(阴性对照组除外)，置于湿盒内4℃过夜。第二天用PB

7、S冲洗三次，5min／次。加入1：200稀释的生物素标记的二抗，湿盒内室温下作用20min，PBS冲洗三次，5min／次。加入1：100稀释的HP标记的连霉卵白素(Strepavdin)，37℃，湿盒内作用20min。用PBS冲洗三次，5min／次。加入新鲜配制的DAB液显色，显微镜下观察，及时流水终止反应并照相。3结果3．1光镜下细胞形态从人脐静脉分离下来的内皮细胞最初为圆形或椭圆形，细胞贴附在培养瓶后很快生长成数个多角形细胞集落，2-3天后备集落可融合成疏松的单层细胞，3-5天后可完全融合成连续的细胞单层，细胞间排列紧密，呈鹅

8、卵石样，无重叠生长现象，并且胞核明显。传代培养的内皮细胞，体积增大，胞浆丰富，呈短梭形及多角形，细胞排列稍稀疏，见图l。3．1．2免疫细胞化学染色根据内皮细胞膜表面特异性表达Ⅷ因子相关抗原的特性，用免疫细胞化学染色法对培养的内皮细胞Ⅷ因子相关抗原进