蠲痹颗粒对胶原性小鼠关节炎抑制作用与机制分析

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1、蠲痹颗粒对胶原性关节炎小鼠抑制作用及机制研究药制字20082554A)。在我院临床使用16年，在云南省中医医疗集团54家医院推广应用6年余，显示了良好的临床疗效，且未发现明显毒副作用，倍受广大RA患者欢迎。然而蠲痹颗粒治疗RA主要作用机理尚未阐明，有必要进行深入研究。本课题主要以T细胞亚群平衡为切入点，在人类RA的经典动物模型一牛II型胶原诱导的DBA／1小鼠关节炎上，探讨蠲痹颗粒通过影响Th细胞亚群间平衡而介导治疗类风湿关节炎的分子机制，以期揭示“温阳散寒除湿法治疗痹证(风寒湿痹)”理论的现代生物学特征及内在规律，阐明著名中医学家吴佩衡及学术继承人云南省名老中医一吴生元教授应用扶

2、阳理论治疗痹证临床中药优效的科学基础，为推动蠲痹颗粒进一步研究奠定扎实的基础。材料、方法与结果1实验材料1-1动物BALB／c纯系小鼠，雌性，18—209，成都达硕生物科技有限公提供，合格证号：SCXK()IJ)2008—24；DBA／1小鼠，7-8周龄，体重20—229，雄性，成都达硕生物科技有限公司提供，合格证号：SCXK(川)2008．24。动物均饲养在云南省中医中药研究院SPF级动物房，实验动物至少饲养一周后使用。温度22+1℃，湿度55士5％，12小时光暗循环；饲料和水均在消毒后由动物自由摄取；所有实验均严格按照实验动物有关条例进行。1．2主要药物及试剂蠲痹颗粒(浸膏每克含生药

3、量为1．14克)，云南中医学院第一附属医院制剂中心提供：丙酮、橄榄油购白天津化学试剂有限公司，批号：20050329；醋酸，购白天津市风船化学试剂科技有限公司，批号：20090912；胎牛血清(fetalbovineserum)，购自Hyclone公司fLogan，Utah，USA)；RPMI一1640培养基，购自GibcoBRL公司(1ifeTechnologies，Grandisland，NY，USA)：3H．胸腺嘧啶脱氧核苷(3H．thymidine)，购自中国科学院上海原子核研究所；IFN．Y、IL．10细胞因子ELISA检测试剂盒，购自BDPharMingen公司fSanDie

4、go，CA，USA)：2,4二硝基氟苯(DNFB)、霉酚酸酯、弗氏完全佐剂(CFA)均购自Sigma公司(St．Louis．MO，USA)：苏木精．伊红(H&E)、福尔马林购自国药集团化学试剂有限公司；甲氨蝶呤片(MTX)，上海信宜药厂，国药准字H31020644，规格：2．5mg／片。1．3主要仪器YLS．Q4耳肿打耳器购自山东省医学科学设备站：离心机购自上海手术器械厂，型号：80．1；天平德国Sartorius电子天平，型号：BP310；酶标仪一infiniteTM200系列多功能分子检测仪系统，型号：Infinite，规格：F200／M200；德国Sigma高速台式冷冻离心机，型号

5、：Sigma3—30K：石蜡切片机，厂家：ShandonSouthernProductLtd．；BM．Will生物组织包埋机，冷冻台，CS．VI型摊片烤片机，TS．12G生物组织自动脱水机厂家：湖北蠲痹颗粒对胶原性关节炎小鼠抑制作用及桃制研究省医用电子仪器厂；OLYMPUSBX51显微镜，厂家：同本奥林巴斯有限公司；Moticam显微镜摄像头，厂家：上海新振仪器设备有限公司；BCD—l90W容声冰箱，厂家：广东科龙电器股份有限公司。2实验方法2．1蠲痹颗粒对小鼠迟发型超敏反应免疫抑制作用的研究2．1．1试验方法及评价取体重18．20克的BALB／c纯系雌性小鼠，随机分组，将丙酮：橄榄油(

6、4：1)作溶剂、O．5％的2，4二硝基氟苯(DNFB)溶液209l，涂抹在小鼠的每只后腿上致敏；第一次致敏后的第5天，用0．2％DNFB溶液涂抹在小鼠左耳两侧进行免疫攻击。右耳单涂丙酮：橄榄油(4：1)溶剂作为对照；实验共设3个组，每组10只，即模型对照组(溶剂对照)，阳性对照组(霉酚酸酯1mg／kg)，蠲痹颗粒给药组(蠲痹颗粒浸膏1．899／kg，相当于生药2．169／kg)；DNFB攻击前、攻击后12小时各给药一次。DNFB免疫攻击后24小时用打孔机打下小鼠左、右耳片称重，计算出两耳的重旦些里左o2．2蠲痹颗粒对胶原诱导性小鼠关节炎的抑制作用及机制研究2．2．1关节炎的诱导及病变评定

7、牛II型胶原加入0．1M的醋酸，浓度10mg／ml，提6订4天4℃冰箱溶解，胶原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，待雄性DBA／1小鼠麻醉后，于其尾根部进行致敏，509l／只，3周后以相同剂量进行再次免疫攻击，肉眼观察小鼠四肢，对关节炎的严重程度进行0．4级评分‘刀，每组小鼠四肢评分总和除以小鼠只数，取平均值作为临床评分。f0．4级评分系统：O=正常；1=一个或多个趾关节红或红肿：2=踝关节以下中度红肿：3=包括膝关节在内的严重红肿；