胃癌组织中e-cadherin和s100a2表达和其临床生物学行为关系的研究

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1、·中文论著摘要·胃癌组织中E-cadherin和肼秒伽2表达与其临床生物学行为关系的研究胃癌在全世界范围内是发病率最高的癌症之一，但其发病机制不清，目前尚不能有效地预防其发生及治疗。肿瘤转移是恶性肿瘤的重要生物学特征，肿瘤转移的研究始终是一个令人关注的重要课题。肿瘤转移涉及许多基因的改变，目前已经发现与肿瘤转移密切相关的基因有MMP，NM23、TIMPl、TIMP2，WDNM、H2-K、1NOS、KISSl，CAVl、S100A4、MTAl、KIT徊^删M等。细胞黏附分子E．eadherin蛋白是维持上皮细胞极性及细胞间连接的糖蛋白，其结构和功能的异常可导致细胞间黏附能力减弱，在肿瘤的

2、浸润和转移中发挥重要的作用。SIOOA2是S100基因家族中的一员，是该蛋白家族中唯一与肿瘤生长呈负相关的蛋白质分子。$100A2基因作为候选抑癌基因，在许多恶性肿瘤中表达明显降低，在肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用。Tsai等研究发现S100A2的表达能减弱肿瘤细胞的运动性和侵袭能力，与肿瘤的转移及浸润密切相关。表观遗传(epigenetic)的变化是真核基因组一种独特的调控机制，主要通过DNA(DNAmethylation)甲基化、RNA沉默和组蛋白修饰等方式来控制基因的沉默。DNA甲基化是基因组内一种重要的碱基修饰现象，是重要的表观遗传调控方式之一，在胚胎发育、遗传印记和x染色

3、体失活中发挥着重要的作用。最近10多年来，通过对DNA甲基化模式的研究，人们发现许多种类的癌细胞都有着异常的DNA甲基化行为，表现为基因组范围的低甲基化和特异位点的高甲基化。基因组范围的低甲基化可通过影响染色体的稳定性而启动癌的发生，实验表明鼠单纯DNA低甲基化可以诱导T淋巴细胞瘤。特异位点的高甲基化是指肿瘤抑制基因常常被过量地甲基化而导致失去活性，而被看作是抑癌基因沉默的“第二次打击”事件。如VHL，HIC-I，Rb，川5，P16等基因在许多肿瘤中发现他们的启动子区发生异常的甲基化。RNAi(RNAinterference)技术是近年发展起来的基因沉默技术，是利用双链RNA(dsRN

4、A)特异性地降解与其同源的mRNA序列，从而特异性地阻断相应基因的表达。RNAi作为一种替代基因敲除的简单有效的工具，在功能基因组学研究、基因治疗等领域受到越来越多的重视。本研究采用半定量RT-PCR方法及免疫组化方法检测了不同进展时期的胃癌组织标本、配对癌旁组织及正常胃黏膜组织E．cadhedn和$100A2的表达情况，分析它们与肿瘤临床特征的相关性，揭示了它们在胃癌进展中的作用；进一步采用甲基化特异性PCR方法，检测胃癌组织标本E-cadherin及8100A2基因启动子区甲基化情况，以揭示基因表达下降的机制及胃癌发病机制；采用RNAi技术，在E．eadherin和S100A2表达

5、阳性的胃癌细胞系．MNK45细胞同时沉默E．-cadherin和$100A2基因表达，观察干涉后的细胞效应，以研究E．eadherin和S100A2的功能及在胃癌发生中的作用机制。材料及方法l、实验材料①组织标本：不同进展期胃癌组织标本64例，正常胃粘膜标本15例，均来自辽宁省肿瘤医院。②细胞株：MKN-45，来源于低分化腺癌，来自中国医科大学细胞生物教研室③质粒：pNe0．RNAi-E-cadherinsiRNA，pNeo—RNAi-SIOOA2siRNA表达载体由美国加州大学惠赠。2、实验方法①半定量RT-PCR：Trizol试剂提取组织标本和细胞总RNA，反转录为cDNA，PCR

6、扩增E-cadherin和SIOOA2特异性片段，以fl-acan为内对照，进行半定量分析。②免疫组化：制备组织标本石蜡切片，用E．cadherin和S100A2特异性抗体进行杂交，统计分析蛋白和基因表达与临床特征间的相关性。③甲基化特异性PCR：酚氯仿提取胃癌组织标本DNA，亚硫酸盐修饰DNA后，纯化产物。用甲基化特异性引物进行PCR扩增，检测扩增结果并进行统计分2析。QWestemBlot：检测RNA干涉后MKN-45细胞中E．eadherin和S100A2蛋白表达情况。@Mar实验：检测RNA干涉后MKN．45细胞增殖情况。(查)Transwell实验：分析RNA干涉后细胞侵袭力

7、的变化情况。挂电三日7R1、E．cadherinRT-PCR结果：正常对照胃黏膜组织E-cadherin基因表达阳性率为100％，不同进展期的胃癌组织基因表达的阳性率下降。E-cadherin在64例胃癌的表达量为1．2454-0．153，而正常胃组织的E．cadherin表达量为2．1054-0．216，差异有显著(P