水痘-带状疱疹病毒临床分离株基因特征的分析

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1、安徽医科大学硕士学位论文中文摘要水痘-带状疱疹病毒临床分离株基因特征分析目的：研究合肥地区水痘-带状疱疹病毒（Varicella-zostervirus,VZV）的分子流行病学特征，明确本地区临床分离株的主要基因型及其与国外各地区基因型的差异，并进一步追踪引发感染毒株的来源和特征，了解可能的疫苗反应及病毒的进化状态。方法：从临床采集水痘或带状疱疹患者皮肤水疱液标本61份，分别接种至人胚胎成纤维细胞(HF)，进行病毒分离；对分离得到的病毒株应用间接免疫荧光法鉴定后，体外培养病毒并提取DNA。经过PCR扩增VZV开放读码框(ORF)1，6

2、，21，22，38，54，62的部分片段，通过限制性片段长度多态性分析（RFLP）对ORF6，38，54和62的AluI、PstI、BglI、SmaI、NaeI和BssHII酶切位点的突变情况进行分析；对ORF1、21、22和54的PCR产物进行测序，分析其中一些特定SNP位点的突变情况，从而确定其基因型别；PCR扩增VZV糖蛋白gB(ORF31)、gE(ORF68)、gH(ORF37)、gI(ORF67)、gL(ORF60)和早期蛋白IE62(ORF62)全长，对PCR产物测序，分析其中SNP位点的突变情况，并使用MEGA4.02软

3、件用邻接法（neighborjoining）构建进化树。对筛选到的基因型为疫苗相关的分离株进一步分析ORFs1、31、51和62中的SNP位点以获取病毒学证据，并对患者进行回顾性调查以寻找毒株可能的来源。结果：从临床采集的61份标本中经病毒分离鉴定后得到阳性标本44份，病毒分离阳性率为72.1%。分离株RFLP分析结果显示，44份临床分离株中酶切特征为-++---AluIPstIBglISmaINaeIBssHII的有42例（96%），与疫苗亲本病毒（p-Oka株）一--+-----+致为AluIPstIBglISmaINaeIBss

4、HII有1例（2%），另1例为AluIPstIBglI+++SmaINaeIBssHII，与疫苗株（v-Oka株）一致（2%）。分子病毒学证据和回顾性调查显示由疫苗株VZV引起的水痘，病毒系从其一位接种过疫苗后患了带状疱疹5安徽医科大学硕士学位论文的男童感染而来。三种基因分型方法显示43例毒株为J/J1/C型，1例为J/J2/B型，同时还发现我们以往报道的在ORF1中核苷酸780～781位点之间插入3个核苷酸CGG的现象在新分离的毒株中也存在（18.2%）；另外，在所有分离株ORF60SNP101623～101624之间插入了3个核苷

5、酸ATC，其中还有4例毒株SNP101245发生了A>G的同义突变（9.1%），其中2例毒株ORF1同时也发生了3个核苷酸的插入突变。进化分析提示这些变异使病毒分成4个亚支。结论：本研究显示：一、合肥地区VZV毒株的遗传特征高度保守，J1型占绝对优势，根据有限的变异位点可将44例毒株分成4个亚分支。二、本地区存在疫苗引起水痘的病例，分析ORFs6、62中的限制性片段长度多态性能够区分疫苗株和野毒株，对ORFs1、31、51和62中的单个核苷酸多态性位点进行分析还可以追踪疫苗--+---致病的毒株来源。三、在我国首次发现了罕见的AluI

6、PstIBglISmaINaeIBssHII毒株，该毒株系亚洲除日本以外的首例。研究VZV的基因特征对积累我国水痘-带状疱疹分子流行病学基线数据具有重大意义，同时也有助于监测和阐明VZV的传播机制。关键词：水痘-带状疱疹病毒；基因分型；v-Oka株；p-Oka株；临床分离株6安徽医科大学硕士学位论文AbstractGeneticAnalysisofClinicalVaricella-ZosterVirus(VZV)IsolatesinHefeiObjectiveGenotypingofvaricella-zostervirus(VZV

7、)strainsisolatedfrompatientswithvaricellaorzosteranddifferentiatingthemfromOkavaccinestrainbymolecularanalysis.Identifypossiblevaccineadversereactionsinvaricellaorzosterpatients.MethodsInthepresentstudy,VZVswereisolatedfromskinlesionsofvaricellaorzosterpatientsintheDerm

8、atologyClinicoftheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversityandweregenotypedbyanalyzingDNAsequencevariati