应用自制组织芯片分析叶酸受体β在结核肉芽肿中的表达中的意义

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1、I万方数据摘要背景与目的结核病是世界上第二大传染病，2014年结核病新发病例960万，死亡150万，新发病例中有120万为HIV阳性，48万为耐多药结核，耐多药结核中的9%为广泛耐药结核，也就是说，约有5万结核患者在目前医疗条件下无法治疗。在中低收入的国家中，2015年结核病的总负担为80亿美元。2014年5月19日，WHO在世界卫生大会上通过了―在2015年后的全球结核预防、治疗和控制的策略和目标‖，目标是结束全球结核病疫情，2035年达到结核病死亡数目减少95%，发生率降低到90%的目标，同时使结核病罹患家庭免受灾难性的花费。随着耐多药结核和免疫相关疾病伴发结

2、核病和免疫制剂使用者结核病的产生，受近几十年的化学治疗抑制的结核疫情大有死灰复燃之际，这给了广大的医务工作者对结核的治疗又有了新的挑战；同时世界上有1/3的人感染过结核杆菌，而仅有5-10%的感染者发展为结核病病人，其他以潜伏感染的形式寄生在人体当中，一但因为各种原因导致机体免疫力下降，就有可能导致体内的结核杆菌失控，而造成结核病的发生。病理组织芯片是由数十至上千个组织整齐地排列在一张载玻片上而制成的组织芯片，是已经应用于肿瘤分子病理学研究的技术，最早在1998年由Kononen等报告，当时主要用病理组织芯片进行肿瘤组织中的DNA、RNA和蛋白质的原位测定和分析，

3、后逐渐拓展到组织染色，荧光染色，病理教学，病理标准化培训和测定，原位杂交和荧光原位杂交。特别是生物芯片信息计算机处理系统的产生，病理组织芯片已经可以使用计算机自动分析。与传统的病理切片相比，病理组织芯片可以大量的快速自动化处理，这样可以大大减少人工，同时大量病理组织在相近的条件下进行病理识别处理，使诊断过程更标准化。病理组织芯片提高效率、明确诊断的同时，还可以测量病变组织中的特异的基因，mRNA和蛋白质等物质的特异性改变，同时减少了组织需要量，一次实验即可获得大量结果。经查阅文献，目前尚无文献报道结核病理组织芯片的制作和应用，本研究试图通过收集一定数量的病理确诊结

4、核病例手术中的病灶组织，制成结核病理芯片。并使用该病理芯片作为研究结核病的平台，研究结核病变组织原位的细胞因子与结核杆菌感染状态II万方数据的关系，结核病变特异性基因变化情况，以及结核病灶巨噬细胞的变化情况等，并为结核病诊断、治疗，后期体外模型和体内模型实验提供理论依据。方法1.收集2015年5月至2016年12月在复旦大学附属上海市公共卫生中心胸外科住院、确诊并手术的患者50例作为实验组，其中男性27例，女性23例，平均年龄33岁，其中淋巴结核18例，骨关节结核12例，椎体结核11例，胸壁结核2例，结核性胸膜炎或肺结核7例。术前抗结核治疗0-96个月，排除合并有

5、肿瘤患者。严格遵循外科无菌原则行结核病灶清除术，在已切除的标本中在无菌条件下进行组织收集，包括结核病灶的坏死肉芽肿组织及临近正常组织，术后进行常规病理检测，仅保留术后病理抗酸杆菌染色阳性的组织入组。同时收集患者临近正常组织（距结核病灶边缘3cm以上的正常组织）50例作为阴性对照组。阳性对照组为正常人的脾脏组织（脾破裂等无其他脾脏疾病者）50例，其中男性36例，女性14例，平均年龄29岁。生理盐水冻存管50例作为空白对照组。2.应用自制组织芯片技术将4组标本分别按阵列设计顺序依次放入受体蜡块中，融合、切片、捞片、烤片制成需要的组织芯片。3.将制成的病理组织芯片进行免

6、疫组织化学染色，应用共聚焦显微镜检测病理组织芯片中Frβ等物质的变化情况，分别对得到的数据进行分析，观察结核肉芽肿，病变周边组织及临近正常组织得出结核感染状态和Frβ等物质的变化关系，所得实验数据用SPSS22.0统计软件分析，以P<0.05表示有统计学差异。结果1.病理组织芯片制作：外观：芯片各点排列整齐，染色层次分明，组织切片厚薄均匀，清晰，缺片率低，组织折叠少见。形态学检查：病理芯片由于切片较小，理论上有一定的信息缺失，但实际观察与传统病理切片差距不大。准确率：实验组与传统病理结果的符合率98%，其中有一例颈部肿物与传统病理不符合。2.免疫组化实验结果：对收

7、集的病人组织病理资料制作成病理组织芯片，其中FRβ、结核抗体在结核分枝III万方数据杆菌反应性巨噬细胞中的含量，与阴性对照组相比明显增加（P<0.05）。结论1.成功制作第一种结核病理组织芯片，结核病理组织芯片制作简单易行，有望成为一种新型的结核病诊断方法。2.Frβ在结核分枝杆菌反应性巨噬细胞中表达上调与结核分枝杆菌感染有关，以Frβ为靶点的结核病的分子靶向治疗在理论上具有可行性，值得进一步研究。3.结核抗体在结核病灶中部分病例中浓度升高，结核抗体结核病灶中的变化与结核感染有关。关键词：结核杆菌，病理组织芯片，叶酸受体β，结核抗体IV万方数据ABSTRACTBa

8、ckgro