尸体脑组织降解代谢组学变化与其推断死亡时间的分析

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1、汕头大学医学院硕士学位论文中文摘要目的和意义准确地推断死亡时间(PostmortemInterval,PMI)一直是法医学鉴定难题，也是一项历史性的重要研究课题。本实验利用代谢组学、生物力学和形态学的理论和技术，探讨在不同温度情况下，家猪脑组织随PMI的时序性变化规律。材料与方法屠宰场放血处死的成年家猪(约4个月龄，体重120~150kg)，提取大脑组织，置于恒温恒湿人工气候箱内自然腐败。气候箱温度设置75%RH，温度设置3个处理组(15℃、25℃、30℃)，分别于0h~96h、0h~84h、0h~72h每隔6h按“六定”标准化规范取材，备制脑组织匀浆液，进

2、行80%乙醇固定萃取-甲醇二次提取脑组织匀浆，以正亮氨基酸为内标，MTBSTFA衍生化后GC-MS检测，定性定量检测各物质峰。同时25℃组观察记录并标准化拍照装置拍照各PMI脑组织大体形态变化，利用PhotoshopCS6软件计算RGB、R、G和B值；脑组织以4%甲醛固定，备制生物力学检测试件和常规制作脑组织石蜡切片，试件行生物力学纵轴单压缩检测，切片分别HE、Glees神经纤维染色，进行量化病理学分析，计算脑白质空白间隙RE及IOD。所有结果以均数±标准差表示，采用SIMCA13.0.3、SPSS20.0、GraphPadPrism5等软件进行统计分析，包

3、括PCA、PLS/OPLS-DA、散点图、线性回归和Kruskal-Wallis检验等。结果1、方法学考察改良微波辅助衍生化方法筛选最佳的反应条件，反应媒介为吡啶，于微波低火条件下衍生化反应2min。考察仪器精密度、线性、重复性和稳定性等，大部分物质的RSD均在允许范围内(<15%)。2、GC-MS检测V万方数据汕头大学医学院硕士学位论文(1)对各温度组的可分辨峰进行主成分分析以了解各个温度组代谢物质的降解规律和趋势，得分散点图结果示：除15℃组各时间组区分不明显外，25℃和30℃组前后平台期和窗口期的时间点可彼此分开，且30℃组变化比25℃组快1个时间点(

4、即6h)。3个温度组总的得分散点图表明3个温度组大部分时间点可相互区分开，部分交叉点的时间为各温度组前平台期。(2)对各温度组的可鉴定物质峰进行PLS模型建立，得分散点图结果示：不同温度组存在不同的时间区分组，与PCA结果相仿。3个温度的排列试验图均表明模型是可接受=0.9999X+0.2716(R2=0.8759)、Y的，YPerdictedPlot的回归曲线分别为：Y15℃25℃=1.0003X+0.3163(R2=0.9273)和Y230℃=0.9989X+0.4899(R=0.9552)。各温度组VIP值法和Kruskal-Wallis检验筛选出重要

5、的生物标志物质数分别为11、18和15。以PMI为Y变量，温度和各代谢物质的相对定量为X变量，建立OPLS-DA模型的得分散点图可明显区分3个温度组，而且，30℃组的大部分物质的平均生成速率是15℃组的3.5~24倍；25℃组的大部分物质的平均生成速率是15℃组的2.5~14倍。(3)线性回归分析：各温度组的大部分物质的含量随PMI变化，回归模型和参数检验均有统计学意义，决定系数和估计标准误大小与PLS回归模型的VIP值大小顺序相当。各温度组的逐步多元回归方程分别为：15℃组YPMI=2.241+22.51X琥珀酸+161.7X缬氨酸+125.3X25-氨基

6、缬草酸(R=0.840、SE=11.60)；25℃组YPMI=6.610+16.29X十八烷酸+14.56X5-+5.517X(R2=0.909、SE=6.323)或Y氨基缬草酸丙氨酸PMI=15.78+9.690X5-氨基缬草酸+86.45X亮氨酸–82.35X(R2=0.952、SE=4.271)；30℃组Y甘氨酸PMI=7.187+7.405X琥珀酸+12.27X5-+6.798X(R2=0.896、SE=6.611)。氨基缬草酸缬氨酸3、生物力学和形态学变化(1)大体形态和RGB值变化：随着PMI延长，脑组织从表面湿润光滑、血管纹理清晰，逐渐到灰暗无

7、光泽、血管模糊，直至消失；从略有弹性、质较软、有形，逐渐到瘫软、腐败液渗出、泡沫状，直至完全液化；从无臭味到发臭，最后臭味又消失。RGB值与PMI存在一定相关性，其中R值在0h~30h线性关系最好：YPMI=-0.314XR+55.41(R2=0.779、SE=4.898)(2)组织生物力学形状参数：甲醛固定脑组织的生物力学参数中，与PMI显著相关的有极限载荷、平均力、最大模量、断裂能量，均呈时序性下降趋势(P<0.05)，回归方程分+58.94(R2=0.888、SE=6.542)，Y别是YPMI=-4.314X极限载荷/最大力PMI=-3.990X断裂能

8、量+53.62(R2=0.770、SE=9.143)