比较人和兔细胞dna降解来推断人死亡时间的可行性分析

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1、-骨骼肌细胞核DNA含量有规律下降。80年代以来，陆续有用不同的方法研究测定死后组织DNA含量，均呈现逐渐下降的趋势，并与死亡时间有显著的相关性，有关报道均显示在死后6小时内DNA含量基本保持不变。1989年国内齐风英首次用流式细胞仪分析了大鼠死后心、肝、肾细胞悬液的DNA含量情况，发现个体差异较小，6小时内细胞DNA含量变化不显著，12-24小时下降显著，30-48小时下降趋于缓慢，以后有规律下降至消失。1994年Cina又使用流式细胞仪研究了人的脾组织的DNA含量随时间变化情况，并得出了DNA含量变化与死亡时间的规律关系。1998年DiNunno等用

2、FCM方法对人死后组织细胞的DNA变化情况进行观察发现，脾等组织细胞在死后72小时内呈一定规律下降，DNA含量与死亡时间有较强相关性，72小时以上DNA大量降解变性，FCM无法测定出有效数值。2000年刘良等[20]用图像分析技术对大鼠死后脑、肝组织细胞DNA变化与死亡时间进行了研究，选择了异形指数、平均光密度、积分光密度、等效直径、面积、密度变化数、平均灰度等指标，并得出了回归方程，发现细胞核DNA降解速率在不同时间内存在不一致现像，确立了通过聚类和判别分析筛选合适参数、合适脏器，建立多参数、多脏器、多元回归方程的可行性。综上所述，学者采用了各种方法来

3、研究死后DNA含量变化规律，结果一致，都认为组织细胞DNA含量随时间有规律下降到消失，具体量化确立有待更深层次研究。DNA为生物体细胞中的遗传物质，其结构及含量相当稳定，任何特定物种的体细胞中每个核DNA平均含量不变，机体死亡后，体细胞核DNA含量在一定时间内有规律地下降，而且已建立了高特异性的组织细胞DNA定量检测法，因而应用DNA测定技术推断死亡时间是一种有效的方法。组织微阵列具有高通量、快速、平行检测大批量组织样本的功能，一个切片含多个实验指标，大大提高实验效率；同时，相同条件下进行比较可以减少组内和组间差异。因制作过程自动化，可人为控制各样本组织

4、排列位置，便于设置各种对照。利用组织芯片结合图像分析技术测定机体死后组织细胞DNA变化，寻找DNA降解与PMI相关性规律，因为样本量的增大，条件的一致性、可比性增强，必将建立一个多参数、多脏器的多元回归方程，为准确推断PMI成为可能。组织微阵列结合图像分析技术测定DNA含量推测死亡时间的方法目前未见报道。本实验在龙仁等人对小鼠等动物组织DNA研究基础上，首次利用组织芯片结合计算机图像分析技术研究组织中DNA的降解和PMI的规律，力求找出更为精确的推断PMI的方法。-8-------技术路线新西兰兔51只随机分为17组，每组各3只收集人体离体组织↓↓颈动脉

5、放血处死后在0-96h每间隔4h解剖一组在0-96h每间隔4h取材肌肉、皮肤↓↓10％甲醛固定↓蜡块制作、匀厚切片↓HE染色、标志典型部位↓蜡块取材、组织芯片蜡块制作↓组织芯片切片↓Feulgen染色↓计算机图像分析↓统计分析-9-------第一部分自然条件下兔组织细胞核DNA含量和死亡时间的相关性探讨材料与方法一、材料1.1主要试剂及配制（1）无色schiff试剂[13]材料：碱性品红(fuchsinbasic,C19H18N3C1)、偏重亚硫酸钠(sodiumpyrosulfite,Na2S2O5,上海试剂四厂)、浓盐酸、活性炭步骤：[1]蒸馏水2

6、00ml煮沸。[2]煮沸后离火，徐徐加入碱性品红1.0g并充分振荡溶解。[3]溶液冷却至55℃后过滤并加入IN的HC120ml。[4]溶液冷却至25℃加入偏重亚硫酸钠1.5g密封后置4℃冰箱24h。[5]加入活性炭2g充分振荡。[6]过滤（滤液应为无色）（2）Carnoy固定液：无水乙醇、氯仿、冰醋酸=6：3：1（体积比）（3）无水乙醇（4）95%的乙醇（5）二甲苯(6)PBS液试剂：KCl、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl配制：称取KCl0.2g、Na2HPO42.85g、KH2PO40.27g及NaCl8.5g加双蒸水至1000ml即可。(7)

7、5NHcl的配制：42ml浓盐酸用蒸馏水定容至100ml即可1.2主要仪器1.倒置显微镜是日本Olympus公司产品。2．电子分析天平为上海天平仪器厂产品。3．切片机为德国Leitz公司产品。4．60℃烤箱为恒温箱为江苏太仓医疗器械厂生产，型号101-3-5。5.病理组织漂烘处理仪为常州中威电子仪器厂生产，型号PHY-Ⅲ。6.芯片切片机、脱水机是湖北孝感市亚光医用电子技术有限公司生产。-10-------1.芯片制备仪是辽宁的设备是朝阳恒泰科技有限公司型号HT.1。细胞图像分析系统(PIPS-2020，olympusBX-50显微镜，polaroid数码

8、相机，分析软件由重庆天海医疗设备有限公司提供)二、方法1.1动物及其分组取雄性健