ribr基因在枯草芽胞杆菌中表达的研究

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1、摘要核黄素一5．磷酸酯在生物化学中被称为黄素单核苷酸(FMN)，是核黄索的衍生物及生理活性形式之一，在细胞内作为多种氧化还原酶的辅酶或辅基，参与细胞的多种代谢过程，具有重要的生理作用。核黄素作为商业化产品，已经在医药、食品和饲料等行业有了广泛的应用。核黄素．5．磷酸酯与核黄素具有同等的生理功能，但是核黄素难溶于水，而核黄素．5．磷酸酯具有良好的水溶性。因此，核黄素一5．磷酸酯比核黄素具有更加广泛的应用前景。目前核黄素．5．磷酸酯的工业生产是通过两步实现：首先通过微生物发酵合成核黄素，然后以纯化的

2、核黄素为原料，再经过单纯的化学酯化反应合成核黄素．5．磷酸酯。如果延伸核黄素发酵菌株的核黄素合成代谢途径，一步发酵合成核黄素．5．磷酸酯，将显著降低其生产成本，有利于生产和应用。枯草芽孢杆菌的ribR基因编码单功能的黄素激酶，催化核黄素转变为核黄素．5一磷酸酯。ribR基因与其它未知功能基因构成一个操纵子，调控机制未知，通常处于不表达状态。本文在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌穿梭质粒pHPl3上，连接了中等强度的启动子P，。，构建了表达载体pHPl3．V。通过PCR扩增了ribR基因的结构基因部分，连接

3、到pHPl3．V上，构建了重组质粒pHPl3-VR。重组质粒pHPl3-VR转化核黄素生产菌株枯草芽孢杆菌24A1，得到了转化子枯草芽孢杆菌25。通过培养和发酵观察发现，枯草芽孢杆菌25菌落和液体培养物颜色明显低于24A1，核黄素发酵能力下降了50％左右，结果说明实现了一般基因在24A1中的表达。ribR基因的表达使细胞内核黄素．5．磷酸酯水平提高，强烈的抑制了核黄素操纵予的表达，造成核黄素合成能力显著下降。对枯草芽孢杆菌25胞内外发酵产物的初步检测，没有检出核黄素．5．磷酸酯的积累，推测是因为

4、发酵条件，主要是磷酸盐的供给不足影响了核黄素．5．磷酸酯的过量形成。关键词：枯草芽孢杆菌；ribR基因；核黄素；FMNABSTRACTRiboflavin．5’-phosphate，alsonamedflavinmononucleofide(FMN)，istheramificationproductofriboflavin,andplaysallveryimportantroleinthesystemofbioreaction．Consequently,ithasaprospermarketfu

5、ture，suchashighconcentrationinjectionforthetherapyoflackofvitamin,theadditionoffeedandsoOil．However,presenttheindustrialproductofriboflavin一5’-phosphatemostlycomesfromchemosynthesis，andhencehasacomparativelyhighcost．．Inthisstudy,themethodofbiosynthes

6、isWasdiscussed．Ther／bRgeneinBacillussubtil捃encodesmonoftmctionalflavinkinase，whichwouldconvertriboflavintoFMN．WehaveconstructedplasmidpHPl3-VRwhichcarriestheribRgeneandastrongpromoter．TransformationofpHPl3-VRintotheoverproduce-riboflavin-strainB．subt

7、ilis24A1makestheribRgeneoverexpressed,resultsinthestronglyreductionofriboflavinproduction．FermentationoftheengineeredstrainB．subtilis25showsthattheriboflavinproductionisnearly50％lowerthanthatoftheoriginalriboflavin-producestrain,butnOFMNWasdetected．T

8、heresultsindicatethatoverexpressionofribRgenegreatlyrestrainstheexpressionofriboflavinsynthesis．ButtheFMNdoesnotacuurnulateinthecell．’ThisstudyhassucceededinmodifyingRsubtilis24A1forthefirststep．However,producingFMNbymicroorganismmethodsneedsfurthers