α-乙酰乳酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中整合型表达

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1、Q．乙酰乳酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的整合型表达摘要啤酒中的一种重要风味物质是双乙酰(diacetyl)，它是在啤酒发酵过程中产生的，当它的含量过高时会使啤酒喝起来感觉有馊饭味。因此，除去双乙酰、降低双乙酰含量是啤酒成熟的一个重要标志。然而这一过程在自然发酵过程中通常很缓慢。Q一乙酰乳酸脱羧酶(Q—acetolactatedecarboxylase，EC．4．1．1．5．简称为ALDC)能加速这一过程，它催化双乙酰的前体物Q一乙酰乳酸(Q—acetolactate)脱羧形成乙偶姻(acetoin)，减少双乙酰的生成，而形成的乙偶姻对啤酒口味没有太大影响的。因此在啤酒生产过程中加入a

2、一乙酰乳酸脱羧酶是有效减少双乙酰含量的办法之一O到目前为止，作为一种研究得较透切的微生物，大肠杆菌(眙幽"，幽此cD-j)作为宿主菌成功表达了很多种蛋白质，但大肠杆菌表达系统仍然存在一些缺陷，例如含有内毒素(脂多糖)、具有致病性、蛋白质难于分泌表达、易形成包含体等。枯草芽胞杆菌(毖ej-J『姻s动手j-js)分泌表达外源蛋白能力强，是目前原核表达系统中较理想的宿主。近几年利用枯草芽胞杆菌作为宿主菌成功表达了多种外源基因，例如利用来源于乳酸杆菌、金黄色葡萄球菌等的载体来表达外源基因，这些载体在枯草芽胞杆菌中存在外源基因的克隆表达效率低及分离复制的不稳定的现象，故都不足枯草芽胞杆菌的最佳

3、选择，还有待改进。鉴于此，发展起来了整合载体。整合载体是将外源目的基因整合到宿主菌染色体上，随着染色体一同复制遗传，解决了染色体外复制质粒在宿主中遗传不稳定的问题。当然，一套好的表达系统不仅保持分裂的稳定性、能遗传和能分泌表达蛋白质，此外还应该有一些高效表达的元件(例如具有强启动子等)。本研究以Q一乙酰乳酸脱羧酶基因为研究对象，构建了枯草芽孢杆菌稳定的表达系统。具体方法是采用PCR技术从枯草芽孢杆菌1A75l染色体基因组DNA中扩增出P43启动子，酶切连接到本实验室构建的携带有Q一乙酰乳酸脱羧酶基因的质粒pUCl9一ALDC上，得到重组质粒pUCl9一P43一ALDC。酶切质粒pUC

4、l9一P43一ALDC，将含P43一ALDC基因片段与线性化质粒pMLK83一BN转化到大肠杆菌DH5a，根据同源重组得到重组质粒pMLK83一ALDC，重组质粒pMLK83一ALDC再转化枯草芽孢杆菌lA75l，通过新霉素抗性和淀粉酶失活筛选出重组枯草芽孢杆菌1A751[ALDC]。实验结果表明，枯草芽孢杆菌1A751[ALDC]表达产物能有效分泌到胞外且具有正常的生物学活性。过夜摇瓶培养，上清ALDC酶活达到15．6U／m1，而没整合有外源Q一乙酰乳酸脱羧酶基因的枯草芽孢杆菌为O。SDS—PAGE分析表明，该Q一乙酰乳酸脱羧酶的的分子量约为32kDa。关键词：Q一乙酰乳酸脱羧酶枯

5、草芽孢杆菌同源重组INTEGRATIONEXPRESS10NOFQ．CETOLACTATEDECARBOXYLASEIN删C见￡吣S∞死乙胚ABSTRACTDiacetyl(DA)，whichafIfectingthequalityofbeer’isoneofthemostcommono昏naVorsinbeerfermentation．AccelerationofthestepthatreductionofDAnaVoriseconomicallyimpoIrtanttothebrewingindustry’becauseofreductionof[b～flavoriscosted

6、alotoftimeinmaturationofbeer．Theprecursorofdiacetylis仅一acetolactate．0【-acetolactatedecarboxylase(ALDC)canconVert0【一acetolactatetoacetoin，andacetoinhaslittleef．fectonbeerflavor．So，oneofthebestmethodtoreducetheconcentrationofDAisaddingofALDCto仔eshlyfermentedbeer．Nowada弘peoplewantmoreandmoreforeig

7、ngeneexpressinginsometypeofmicrobe．Thebacteriaof毋c办秽纪办砌cDJ『f，whichwasasthehostusetoproductheterologousproteinsathighleVels．But，f．orinstance，EcD，fisapathogenicbacteriumandhasendotoxins，andsoon．Moreover，itsecretessomekindofproteinin