红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体的制备

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1、陈琦：红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体的制各红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体的制备研究生：陈琦导师：李厚达教授摘要1目的人红细胞血型系统非常复杂，血型抗原的正确鉴别在保证输血安全、调查人种分布、建立稀有血型库及许多疾病的诊断、分型甚至治疗方面都有极其重要的作用。抗原的鉴别有赖于相应抗体的获得。而我国除ABO血型定型试剂外，其它临床及实验所用斑型抗体几乎全部依赖进口，这极大地制约了血型学研究在我国的发展。本研究的E1的即通过常规的杂交瘤技术及目前迅速发展的基因工程抗体技术劁备针对各种血型抗原的单克隆抗体及基因工程抗体，以期获得效价高、特异性强并具有自主知识产权的

2、血型抗体，为它们最终能大规模生产应用于临床及积极开展国际交流、互通有无打下坚实的基础。2方法根据实验目的，本课题内容共分三部分2．1红细胞血型单克隆抗体的制备一分别用健康成人“O”血及胎儿脐血红细胞免疫BALB／c小鼠，经过3次免疫及一次加强免疫，取免疫小鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，通过血凝试验初筛，保留血凝效价达4+的细胞株扩大培养，获得的杂交瘤细胞上清分别用谱红细胞、原核表达的KeU-30e血型抗原多肽及Westernblot进行抗体特异性鉴定，同时进行抗体类型、效价及抗原表位的检测，对部分单克隆细胞株通过腹水扩大培养，以进一步提高其效价。2．2ScF

3、V6wcg-HPVl6E7双功能分子的制各扬州大学博士学位论文用实验第一部分获得的一株抗红细胞血型糖蛋白GPA／GPB的杂交瘤细胞株6D7C9进行RT-PCR，分别扩增其VH、VL基因，并用Linker将其拼接成6D7C9的ScFv基因，转化原核表达载体pBAD／gIIIA，获得的阳性克隆命名为：pBAD·SgFv61)TC9，通过WesternBlot分析及间接血凝试验检测ScFv的蛋白表达及血凝活性。将获得的pBAD—SgFV6DTC9与已有的人乳头瘤病毒16型E7基因片段(I-IPVl6·E7)通过一Linker经PCR拼接，转化，获得的双分子阳性克隆命名为

4、：pBAD·SgFv6DTC9．HPVl6E7，通过WestemBlot分析及间接血凝试验检测表达产物的双特异功能，即其与HPVl6E7抗体和RBC同时结合，并通过血凝反应检测HPVl6E7抗体的能力。2．3Rh(D)抗原Fab抗体的制备收集5份血清中抗Rh(D)效价在1：256．512之间的人淋巴细胞，提取RNA，用多对引物PCR分别扩增其VH、Ⅵ、Vx基因，同时，分别从paomb3xTr和pComb3xA．噬粒中扩增CHI、Q、Cl，通过重叠PCR，构建重链的Fd基因及完整的kappa、Lamda轻链，并进一步重叠PCR，获得Fab抗体片段。Fab经酶切、连接

5、并电转化到噬菌体抗体表达载体pComb3xSS中，构建获得抗Rh(D)的Fab抗体库，经四轮P．h(-)／Rh(+)红细胞阴／阳淘筛，获得的阳性克隆分别进行血凝试验、westernblot分析及测序鉴定。3结果3．1红细胞血型单克隆抗体的制备3．1．1MNSs血型系统mAbs获得的8种杂交瘤细胞株中，其中4株作用于GPA的M表位、1株作用于GPA的N表位；3株为同时抗GPA和GPB蛋白的GPA／GPBmAbs。杂交瘤细胞培养上清效价介于l×2—4-1x2q之间，腹水mAbs效价在l×2-7-Ix2-12之间。除1株mAb，IClC9C4为tgM外，其他7株mAbs

6、均为lgG。通过杂交瘤细胞培养上陈琦：红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体的制备清与谱红细胞的反应格局，结合mAbs抗原表位检测，确定4株、1株mAbs可分别特异性结合于GPA的M、N表位；另3株mAbs，6D7C9、7C9H4和7C9G11，与“O”型血红细胞膜的Westernblot结果显示，它们为抗GPA／GPBmAbs。3．1．2Ii血型mAbs获得了3个抗i的mAbs：AIOG5FgE2E7、A11G5FgE2C4和A10G2。杂交瘤细胞培养上清效价介于lx2-1_1×2-4之间，其中A10G5F9E2E7的腹水效价在1x2-10-1x2—1之间。三株mA

7、bs均为IgG3型。通过杂交瘤细胞培养上清与谱红细胞(含胎儿i血型、成人I血型及成人稀有i血型)的反应格局，确定这3株mAbs特异性结合i抗原。3．1．3Kell血型系统的mAbs获得3个抗Kell的mAbs：4H2A8、2F9F5和4D10Gll，杂交瘤细胞培养上清效价介于l×2-5—1×2-10之间，抗体亚型检测均为IgGl。通过杂交瘤细胞培养上清与Kell蛋白原核表达多肽Kell．30e(kell蛋白C末断的30个氨基酸)的ELISA检测，确定这3株mAbs特异性结合Kell抗原。3．2SeFv6D70．HPVl6E7双功能分子的制备ScFv6D7C9测序结

8、果表明：V