羽衣甘蓝柱头酵母双杂交cdna文库构建及arc1相互作用蛋白质筛选

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1、万方数据UniversityCode：10225RegisterCode：09031DissertationfortheDegreeofMasterConstructionofyeasttwo—hybridcDNAlibraryandscreeningoftheproteinsinteractingwithARC1fromthestigmaofornamentalkaleCandidate：Supervisor：AcademicDegreeAppliedfor：Speciality：Dateof0ralExamination：Un

2、iversity：YangJiaPro．LiYuhuaMasterDevelopmentalBiologyJune，2009NortheastForestry一＼煳IIII必IIII一万方数据!!!!!!!!!!!!!!!!!苎皇!!!竺!!!皇!!竺!!!!!!曼曼!曼!!!鼍!!!!!!!曼!!lm慢m岫I帅lmI¨mmml¨¨ml!!!!一摘要植物自交不亲和性(Self-incompatibility，SI)是指雌蕊对自己和异己花粉进行识别，通过细胞内信号传递与级联反应，最终抑制自己花粉的生长，阻碍受精作用的过程。SI是植物

3、采取的一种促进异交、避免自交的策略。芸苔属植物自交不亲和反应发生的主要部位是在柱头乳突细胞，通过其细胞内的信号级联反应抑制自我花粉的生长。目前，已经鉴定出柱头乳突细胞内SI信号传递因子ARCl(Annrepeatcontaining1)，ARCl是一个含有U．Box功能域的蛋白，具有E3泛素连接酶活性，通过泛素／26S蛋白酶体途径将降解其下游底物，从而导致SI的发生。目前，对于ARCl的下游底物和SI反应机制还尚不清楚。本文以羽衣甘蓝(Brassicaoleraceavar．acephala)＆36西36自交不亲和系为材料，提取柱

4、头总RNA，通过亲和层析法分离纯化mRNA，利用CytoTrapXR建库试剂盒，构建应用于酵母双杂交系统的羽衣甘蓝柱头cDNA文库。原始文库的库容量为2．5×105，扩增后文库的库容量约为4×108，重组率为96％，插入片段大小在0．4．3kb之间，平均长度在0．8kb左右。构建了ARCl全长的酵母诱饵表达载体，转化cdc25H酵母细胞对其进行自激活检测，经验证无自激活现象。以CytoTrap酵母细胞质双杂交系统为操作平台，利用共转化的方法对羽衣甘蓝柱头酵母双杂交cDNA文库进行筛选，共筛选5×105个酵母克隆，经初步验证和测序得

5、到2个蛋白质编码序列。其中一个蛋白含有71个氨基酸，与拟南芥的Nucellin蛋白相似，一致性达79％，Nucellin蛋白是一类新的植物天冬氨酸蛋白酶，可能参与大麦受精过程中胚珠珠心细胞的程序性死亡；另一个蛋白含有288个氨基酸，与拟南芥的DnaJ蛋白相似，一致性达88％，DnaJ是一类分子伴侣蛋白，是热休克蛋白Hsp70的一个辅助蛋白，在蛋白质的翻译、折叠、去折叠、转运和降解过程中发挥重要作用。以上研究为探讨ARCl的功能及S1分子机制提供新的线索。关键词羽衣甘蓝；自交不亲和；ARCl；酵母双杂交；cDNA文库万方数据Abst

6、ractSelf-incompatibility(SI)allowsthepistiltodistinguishbetweenselfandnon．selfpollensofthesamespeciesandrejectselforself-relatedpollens．Manyfloweringplantshaveevolvedthisphysiologicalstrategytopreventinbreedingandmaintaingeneticdiversityinapopulation．Thestigma，inwhich

7、theself-incompatibilityreactiontakesplace，Caninhibitthegrowthanddevelopmentofself-pollenthroughsignalingcascaderesponseinpapillarcellinBrassica．Armrepeatcontaining1(ARC1)，astigmaticU-boxproteinwithE3ubiquitinligaseactivity,functionsasapositivemediatorofSIsignaling．How

8、eveLlittleisknownaboutsubstratesoftheARClintherejectionofincompatiblepollenduringtheSIresponse．Ornamentalkale(Brassicaolerac