以erbb-2受体为靶向活化t细胞抗肿瘤基因治疗基础的研究

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1、万方数据目录英文缩略表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯50独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯64万方数据温州医学院硕fJ学位论义缩略词表IIIIIllIlllllllllIllllIllllllilleIIlY2691909简写英文全称中文全称CTLErbB2FcscFvCytotoxicTlymphocyteV-erb-b2erythroblasticleukemiaviraloncogenehomolog2fragmentcrystallizableregionsinglechainfragmentDMEMDulbecco’SModifi

3、edEagleMediumIL．2PHAFCMTCR0KT．3PCRPBSIFN-YPBMCCDADCCInterleukin2phytahematoagglutininflowcytometryTcellreceptormonoclonalCD·3antibodypolymerasechainreactionphosphatebuffersalineInterferonYPeripheralbloodmononuclearcellClusterofdif!f．erentiationantibody·-dependentcell·-mediatedcytotoxicityMHCMaj

4、orhistocompatibilitycomplex细胞毒性T细胞表皮生长因子超家族成员抗体水解可结晶片段单链抗体Dulbecco氏改良Eagle培养基白细胞介素2植物血凝素流式细胞术T细胞受体抗单克隆抗体3聚合酶链反应磷酸盐缓冲液Y．干扰素外周血单个核细胞分化抗原抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用主要组织相容性复合物TAATumorassociatedantigen肿瘤相关抗原G418Geneticin新霉素万方数据温州I医学院硕j

5、学位论义以erbB一2受体为靶向的活化T细胞的抗肿瘤基因治疗基础研究摘要目的：本研究将重组表达质粒pLNCX／anti．erbB2scFv．Fc．CD2

6、8．CD3(O先转染T细胞株Jurkat，然后转染外周血T细胞，筛选并检测蛋白表达。进一步检测转染阳性外周血T细胞的活化程度，特异性结合、杀伤erbB2阳性肿瘤细胞的能力。即构建含融合基因anti．erbB2scFv．Fc．CD28．CD3(O的外周血T细胞，为erbB2过表达肿瘤的靶向基因治疗奠定实验基础。方法：1．重组表达质粒转染人T细胞株Jurkat、筛选、鉴定、蛋白表达检测应用脂质体法和电转染技术将重组表达质粒PLNCX／anti．erbB2scFv．Fc．CD28．CD3(O转染至Jurkat细胞株，先用流式细胞术检测融合基因瞬时表达情况，然后用含1000“g／mLG418

7、的RPMll640培养液筛选转染阳性Jtirkat细胞株，筛选后，PCR鉴定融合基因，应用流式细胞术、RT-PCR、Westernblot检测融合基因的稳定表达情况。2．重组表达质粒转染人外周血T细胞、筛选、鉴定、蛋白表达检测从人外周血中分离培养T淋巴细胞，采用电转染技术将重组表达质粒PLNCX／anti．erbB2scFv．Fc．CD28．CD3(O转染至外周T，用含600pg／mLG418的RPMll640培养液筛选转染阳性T细胞，先用RT-PCR技术检测融合基因表达情况，然后用westernblot验证蛋白表达情况。3．转染的外周血T细胞结合erbB2阳性肿瘤细胞SK-BR．3

8、能力的检测实验组在6孔板中每孔加入lml2x106转染的外周血T细胞和lml1×105erbB2阳性肿瘤细胞SK．BR．3，体外共同培养48小时后，在显微镜下观察转染的外周血T细胞结合SK．BR．3的情况，SK．BR．3细胞数量和形态的变化。以未转染的外周血T细胞和SK．BR．3共同培养为阴性对照组。4．ELISA夹心法检测转染的外周T与靶细胞共同培养后上清中IL．2和IFN-T的含量把转染的外周血T细胞与erbB2阳性肿瘤细胞株SK-BR-3在体外共同培