pdx-1在大鼠骨髓间充质干细胞转分化为胰岛样细胞中的作用及其机制研究

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1、郑州大学博士学位论文PDX－1在大鼠骨髓间充质干细胞转分化为胰岛样细胞中的作用及其机制研究姓名：袁慧娟申请学位级别：博士专业：内科学（内分泌）指导教师：秦贵军201009摘要PDX．1在大鼠骨髓间充质干细胞转分化为胰岛样细胞中的作用及其机制研究博士研究生袁慧娟导师秦贵军教授郑州大学第一附属医院郑州450052摘要背景：糖尿病是严重危害人类健康的多发病，目前糖尿病的药物治疗方法并不能使所有糖尿病患者达到血糖理想控制。l型和2型糖尿病都存在胰岛B细胞破坏所引起的胰岛素分泌不足，因而胰岛异体移植有望成为较为理想的治疗方法。目前虽然有一些胰岛异体移植成功的

2、报道，但由于受到器官来源、移植条件和宿主移植物间的免疫排斥反应的限制，因此人们更倾向于选择诱导干细胞分化并移植大量诱导分化成熟的胰岛样细胞来治疗糖尿病。骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenehymalstemcells，BMSCs)是存在于骨髓中具有高度自我更新和多向分化潜能的一类非造血干细胞，可以分化为内胚层的细胞如胰岛样细胞和脂肪细胞等。与胚胎干细胞(EmbryonicStemCell．ES)相比，BMSCs具有取材方便、易于分离培养、体外扩增能力强、遗传性稳定、易于转染和稳定表达外源基因、避免免疫排斥反应、且不存在人胚胎干细胞的伦

3、理、道德问题等诸多优点，是现阶段获取p细胞的理想来源。已有研究证实移植的小鼠骨髓细胞可在体内自行分化为胰腺细胞。在糖尿病小鼠体内，BMSCs可分化为胰岛素分泌样细胞并使血糖恢复正常。BMSCs的分化可被一个或一簇转录因子所诱导。胰岛B细胞的诱导分化，依赖于一种关键的转录激活子一胰腺．十二指肠同源盒．1(Pancreaticduodenalhomeobox．1，摘要PDX-1)，PDX．1作为一种转录激活子，在胰腺的早期发育和晚期胰岛p细胞的分化中起着重要作用。PDX-1基因的突变可导致PDX．1与胰岛素启动子结合能力下降，下调胰岛素的转录并最终引起

4、高血糖状态。选择性破坏小鼠p细胞内PDX-1基因，会发生和年龄相关的、非胰岛素抵抗相关联的糖尿病。因此将PDX-1基因导入BMSCs，促使其分化为胰岛素分泌样细胞从理论上讲是可行的。在该领域虽然已有学者开始进行研究并取得了一些进展，但很多方面仍存有争议，如：BMSCs的诱导分化存在着无效分化、低胰岛素含量、缺少直接分化即非线性分化等问题。为了解决上述问题，将PDX-1基因导入BMSCs，研究BMSCs体外转化为B细胞的分子网络对该技术的完善非常必要。目的：本研究拟构建含有PDX-I基因的真核表达载体，并通过脂质体转染技术，将所构建的重组表达载体转入

5、大鼠BMSCs中，筛选稳定转化细胞株，诱导其向胰岛样细胞分化，通过检测胰岛素分泌量、胰岛素mRNA表达、实时定量RT-PCR检测胰岛细胞分化相关基因的表达如胰岛素、胰高血糖素、Glut2、PDX-1和Ngn3基因，分析在高糖条件下PDX．1对胰岛素分泌的影响并探讨其可能的调节机制。同时，为了探讨在不同PDX．1基因转化细胞株中胰岛素表达水平变化和不稳定的原因，本研究通过鉴定不同转化株中PDX．1基因的拷贝数，分析PDX．1基因的拷贝数和胰岛素分泌之间的关系，为胰岛样细胞移植治疗糖尿病提供理论依据及前期技术准备。方法：1．PDX-I基因eDNA片段的

6、克隆及真核表达载体的构建根据OenBank．E登录的PDX-1的eDNA全长序列设计引物。以提取的总RNA为模板进行RT-PCR，将扩增出的PCR产物连接到pMDl8-T载体上，然后进行测序并与GcnBank上的PDX-1基因序列进行比对分析。。测序鉴定正确的重组质粒分别用引物对应的酶切位点进行双酶切，回收相应的片段。同样对真核表达载体pcDNA3．1(+)及绿色荧光蛋白载体pEGFP．．Cl进行相应的酶切，回收载体片段。用T4DNA连接酶分别连接上述回收的片段，连接产物转化感受态大肠杆菌JMl09细胞，涂板，过夜培养，挑取克隆，提取质Ⅱ摘要粒，双

7、酶切鉴定。2．大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及胰岛样细胞的诱导分化利用全骨髓贴壁培养法分离、原代培养BMSCs，通过细胞免疫荧光鉴定BMSCs的表面标记，显微镜下观察细胞形态变化并测定细胞的生长曲线。通过脂质体技术将构建的重组真核表达载体pEGFP．PDXol转染BMSCs，荧光显微镜观察高糖条件下PDX．1基因定位；G418筛选转染重组载体pcDNA3．1(+)．PDX．1的稳定转化株细胞，并通过反转录PCR(ReverseTranscriptionalPolymeraseChainReaction，RT．PCR)、Westernblotting

8、鉴定PDX．1在MSCs中mRNA及蛋白方面的表达情况，分离稳定转化株。利用I％DMSO高糖诱导稳定转化株向胰岛样细胞分化