【硕士论文】Bax基因重组腺病毒表达载体的构建及其对包装细胞HEK293的毒性作用.pdf

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1、浙江大学硕士研究生学位论文Bax基因重组腺病毒表达载体的构建及其对包装细胞HEK293的毒性作用浙江大学医学院外科学(神经外科)2001级硕士研究生陈鹏导师刘伟国教授中文摘要Oltvai等于1993年用Bcl．2基因蛋白产物Bcl．2特异性单克隆抗体免疫沉淀等方法，从人和鼠B细胞中发现一种与BcI．2共沉淀的(21KD)蛋白质，命名为Bax(Bcl．associatedXprotein)，与BcI．2促细胞存活的作用相反，Bax促细胞死亡。细胞内Bax和Bel．2的比值是影响细胞凋亡的关键。胶质瘤细胞中Bcl．2的高表达，Bax的相对低表达，Bel2／Bax比例的失调与胶质瘤

2、的组织学级别，肿瘤转移能力，肿瘤生长速度，肿瘤复发以及肿瘤对于放疗，化疗的反应性均具有密切关系。如果能够在肿瘤细胞中提高Bax基因的表达，将促进肿瘤细胞的凋亡，提高肿瘤细胞对于放疗、化疗的敏感性。人类腺病毒是双链DNA病毒，具有转染靶细胞后以附加体(episome)形式存在，极少发生插入突变，载体操作方便、容易繁殖，宿主范围广，既可感染分裂细胞，又可感染非分裂细胞，携带外源基因容量大，可表达接近翻译后成熟水平蛋白质等优点，复制缺陷性腺病毒由于其在非包装细胞中不能复制，避免了对周围正常细胞的感染，成为现阶段最好的基因治疗载体之一。我们以复制缺陷性腺病毒为基因转移载体，以人类巨细

3、胞病毒早期启动子为真核基因表达启动子，以Bax旺基因为治疗基因，构建Baxct-pShuttle-Adeno重组腺病毒表达载体，并且证明其具有较高的目的基因转录和表达活性，同时发现由于重组病毒载体Baxt,的表达先于病毒本身复制和包装的发生，以及Bax蛋白对于包装细胞HEK293的毒性作用，导致包装细胞的死亡，而病毒本身尚未完成复制和包装，致使病毒扩增受阻，不能达到基因治疗所需的病毒浓度。这提示我们在将来的实验中可以通过以可控的启动子代替CMV启动子，使含Baxa基因的重组腺病毒在包装细胞HEK293细胞中不表达或低表达，避免Bax浙江大学附属第二医院浙江大学硕士研究生学位论

4、文蛋白对于HEK293细胞的致死性毒性，使重组体得以包装和扩增，从而得到足够的病毒量进行胶质瘤的基因治疗。实验材料和仪器1．主要试剂：Baxct基因全序列由浙江大学生命科学学院潘杰教授惠赠，TGl菌为浙江大学生命科学学院生物化学研究所保存，Adcno．xm表达载体(美国BDBiosciences公司)，HEK293细胞(中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所)，DMEM培养液、1640培养液、胎牛血清(美国Invi仃ogen公司)，，DOSPER阳离子脂质体(瑞士Roche公司)。X-gal试剂、MTT试剂(美国Arnresco公司)，Bax(B．9)鼠抗人单克隆抗体、We

5、sternBlotting荧光显影试剂盒(美国SantaCruzBiotechnology公司)，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H-L)(北,京中山生物技术有限公司)，PacI限制性内切酶(美国NEWENGLANDBiotechnology公司)。限制性内切酶XbaI、ICpnI、BamHI、PstI，DNAMarkerDL2000，DNAMarkerDLl5000(大连宝生物工程有限公司)。2．试验仪器：352型酶标仪(芬兰LabsystcmsMultiskan公司)，TC2323二氧化碳生化培养箱(美国SHELLAB公司)，UV-2401PC紫外分光光度计(日本岛津公司)，

6、X-22R冷冻离心机(德国Beckman公司)，PCR扩增仪(杭州宝诚科技有限公司)，YJ一875型医用净化工作台(苏州长桥净化设备厂)。实验方法用一次性塑料培养瓶，含10％胎牛血清的高糖DMEM，按常规方法培养HEK293细胞，每3天传代1次。以XbaI／KpnI双酶切pShuttle质粒，将双酶切的pShuttle质粒与潘杰教授惠赠的Baxct基因进行连接反应，以BamI-II和PstI酶切鉴定。以PI—SeeI／I·CeuI双酶切Baxa·pShuttle重组体，电泳并回收含Baxa的片断，连接回收的Bax片断和已经PI—SceI／I-CeuI双酶切的Adeno．X基因

7、，PCR鉴定。以同样浙江大学附属第二医院浙江大学硕士研究生学位论文方法构建LacZ．pShuttle-Adeno重组腺病毒载体，PCR鉴定。提纯BaxⅡ．pShuttle-Adeno重组腺病毒质粒后(3．07ug／u1)，以PaeI酶切，苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)提纯酶切产物，提纯后浓度为1．68p∥u1。以Dosper阳离子脂质体转染重组载体进HEK293细胞，5天和8天后换液，10天后传代，离心收集每次换液时脱落的细胞。咀同样的方法转染LacZ．pShuale-Adeno重组腺病毒载体进入