大肠杆菌（e.coli）冷激蛋白cspa启动子区调控表达机制初探

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1、摘要当温度突然降低时，原核生物和真核生物都会表现出冷激反应，它们会通过合成冷激蛋白(coldshockproteins，Csps)来克服冷激的不利影响。CspA是大肠杆菌中一种主要的冷激蛋白，近来研究人员对其结构、功能和在转录、翻译水平的调控及mRNA稳定性等方面作了大量研究。但对于cspA上游调控元件存在的真实性、DB序列以及AT序列的作用机制仍然存在很大的争议。本文以pET-28a(+)为骨架构建以ZsGreen为报告基因，启动子分别为AT序列缺失、DB序列缺失及完整cspA启动子的表达载体，利用R

2、T-PCR、SDS．PAGE及荧光分光光度计检测等方法对比分析三种载体的转录、翻译水平，初步探究CspA的表达与调控机制。实验结果显示：16"C条件下，大肠杆菌CspA启动子DB序列具有翻译增强作用；DB缺失能够提高cspAmRNA稳定性；16℃条件下，大肠杆菌CspA启动子AT序列对转录调控没有显著的作用；冷激2h后，CspA表达受到抑制，可能为转录后水平或翻译水平的调控；低温条件下表达重组蛋白的活性较高。关键词：冷激蛋白；cspA启动子；低温诱导；表达载体。iAbstractBothprokaryo

3、tesandeukaryotesexhibitacoldshockresponseuponanabrupttemperaturedownshift．About26-27cold—shockproteinsaresynthesizedtoovercomethedeleteriouseffectsoflowtemperaturestress．CspA,themajorcold-shockproteinofEscherichiacoli，hasrecentlybeenstudiedwithrespecttoi

4、tsstructure，functionandregulationattheleveloftranscription,translationandmRNAstability,especiallythefunctionofATandDBregionofitspromoter．Inthispaper,plasmidpET-28a(+)wasusedforconstructionofthreelowtemperatureexpression．ZsGreenwasfusedintothepET-28a(+)as

5、thereportgene．WildcspApromoter,DBdeletionpromoter,DBandATdeletionpromotersubstitutetheT7promoterofthepET-28a(+)．InordertoexplorethemochanismofthecspA．RT-PCR、SDS—PSGEandfluorescencespectrophotometrydetectionhavebeenappliedtocontrastandanalyzethetranscript

6、ionandtranslationofthethreeexpressionCarTier．Theresultsshowsthatin16℃，DBfunctionsasthetranslationenhancer,andthedeletionofDBcanmakethestabilityofthecspAmRNAmuchstronger．AThasnotingtOdowiththeregulationoftheespAtranscriFltion．Inaddition,theactivityofthere

7、combinantproteinZsGrcenishigherwhenexpressedinlowtemperaturethaninhightemperature．Keywords：coldshockproteins，cspApromoter；lowtemperature-induce，expressionvector．ii独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包

8、含为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：数&：巡、日期：单血互学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影