卤虫胚胎发育相关基因p26克隆和表达的分析

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1、摘要卤虫是一种生活在世界各地的小型甲壳动物，它们能够抵抗长期缺氧、干燥、极端的温度、高盐、高剂量的紫外辐射等恶劣环境。p26对卤虫抵抗恶劣环境可能起到重要作用。p26是一种小热激蛋白，作为分子伴侣，在防止蛋白变性和聚合，帮助蛋白折叠以及抑制凋亡起重要的作用。p26的表达具有胚胎特异性，只在包囊和进入休眠状态的胚胎中表达。本研究根据GenBank上中国卤虫p26基因的mRNA序列设计引物，以中国卤虫总RNA为模板，经RT-PCR，得到了长542bp的基因片段，该片段的A+T的含量高于G+C的含量，

2、该序列片段经Blastn比对，确认其是中国卤虫p26基因的部分序列。通过对该序列进行ORF分析得出其假定表达的蛋白包含174个氨基酸，而且该蛋白包含a．crystallin结构域。用ClustalW1．83和MEGA3．0软件对该假定蛋白的氨基酸序列和相近蛋白的氨基酸序列进行分子进化分析，构建的进化树分为两支，中国卤虫和其他昆虫的sHSP聚为一支，另外一支是由脊椎动物的sHSP组成。同时本研究对8个地区的两性生殖卤虫p26基因进行了克隆测序，用ClustalW软件比对并用MEGA3．0软件分析其

3、碱基组成即变异情况，并构建分子系统进化树，构建的两支进化树均显示两性卤虫可分为四个类群：第一类群：东亚两性类群；第二类群：中亚两性类群；第三种群：北美类群和第四类群：南美类群。为了分析胚胎发育相关基因p26的表达和胚胎发育的关系，本研究首次用实时定量PCR分析中国山西运城两性卤虫和山东无棣县孤雌卤虫不同胚胎发育时期p26基因的相对表达量，实验结果表明利用实时定量PCR获得了理想的标准曲线，可以在宽广的范围内对目的基因进行检测，对各个样品进行实时定量PCR时，、均获得了良好的扩增曲和融解曲线，表明

4、实时定量PCR方法简便、快速、高效、可行。在胚胎发育的各个时期，中国两性卤虫和孤雌卤虫均表达p26，而且除了0hgb，在其他的几个发育时期，两性卤虫p26基因的表达量均高于孤雌卤虫；在胚胎发育0h时，中国两性卤虫和孤雌卤虫均表达最大量的p26：随着胚胎发育的进行，p26基因的表达量逐渐减少，在胚胎发育16h和24h，p26基因的表达量很低。我们推断p26在胚胎发育过程中保护胚胎抵抗恶劣环境起到重要作用。关键词：卤虫；p26基因；克隆；表达分析；实时定量PCRAbstractArtemiaisak

5、indofsmalIcrustacean，whichdistributeswidelyovertheworld．Theyareremarkablyresistanttoadverseenvironmentssuchaslong·termanoxia，desiccation，temperatureextremes，hypersaline，andirradiation．P26isasmallheatshockproteinthatfunctionsasamolecularchaperonetopro

6、tectembryosbypreventingirreversibleproteindamageduringembryonicdevelopment．Theexpressionofthep26geneisembryo·specific，itexpressesonlyincystsanddiapauseembryos．Inthisstudy，primersweredesignedbasedGOthemRNAsequenceofp26genein一．sinicaavailableintheGenBa

7、nkdatabase．andtotalRNAofA．sinicawasamplifiedbyRT-PCR．Afragmentof542bpwasamplified，andthequantityof(A+T)ishigherthan(c+G)．Thefragmentwasidentifiedasp26ofA．sinicaafteranalyzingbyBlastn．Theputativeproteinp26contained174aminoacidanda-crystallindomain．Phy

8、logenetictreeswereconstructedbasedonthesequencesoftheputativeproteinofp26andothersHSPs(smallheatshockproteins)bysoftwareClustalX1．83andMEGA3．O．P26ofA．sinicaandsHSPsofinvertebratewereclusteredinaclade，andsHSPsofvertebratewereclusteredintheotherelude．D