青天葵分枝发育相关基因nfls的克隆与表达分析

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1、广州中医药大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学馘文储签名莘递企日期：2014年6月3日关于学位论文使用授权的声明本人完全了解广州中医药大学有关保留使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权广州中医药大学可以将

2、本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文导师签名——6月3日本论文获得以下项目资助，特此感谢!中央财政支持地方高校发展专项资金项目一南药可持续利用研究与综合开发利用技术平台(粤财教[20101358号)青天葵分枝发育相关基因UfLs的克隆与表达分析专业：中药学硕士研究生：梁凌玲导师：何瑞研究员摘要分枝是植物为了适应环境而表现出的生物性状，分枝的多少直接影响植物的生物量和结实量。由于顶端优势的存在，侧芽的生长被抑制。研究表明，植物的分枝发育受到

3、多种植物激素的调节。相关分枝基因在不同物种中的保守性，使其在药用植物中的克隆研究成为可能，如兰科植物石斛兰中，克隆得到抑制分生组织的生长、促进茎尖分生组织的形成和早熟开花的DOHl。研究植物分枝相关基因，不仅可以增加对植物发育及其机理的了解，还可以为获得多分枝植株，增加药用植物的产量，缓解某些药用植物资源短缺问题，如濒危的岭南道地药材青天葵等提供理论基础。《广东省中药材标准》收录的青天葵来源于兰科植物毛唇芋兰[Nerviliafordii(Hance)Schltr．】的干燥全草。主要分布于两广、海南等地区。具有清热解毒、散瘀止痛、润肺止咳等

4、功效。主要用于小儿呼吸道疾病、小儿疳积、跌打损伤等。由于青天葵本身繁殖系数较低，市场需求量大，加上人类的过度采挖，其野生资源濒临灭绝，而人工栽培远远不能满足市场需求，因此扩大青天葵的药用资源亟不可待。本论文通过研究从前期建立的青天葵转录组数据中发掘到的一个分枝发育相关基因NfLs，期望为打破青天葵正常情况下每个球茎只长一片叶子的现状奠定基础。主要研究内容包括：(1)为了筛选适合青天葵叶片总RNA的提取方法，本文采用CTAB法、SDS法、RNeasyPlantMiniKit法、RNAisoPlus法、RNAisoforPolysacchari

5、de—richPlantTissue法5种方法，并结合4类抽提试剂，分别提取青天葵叶片总RNA，得到适合青天葵叶片总RNA的提取方法：RNAiSOPlus法。(2)基于青天葵转录组Unigenes数据库，筛选青天葵分枝发育相关的Unigenes，其中Unigene37948与番茄促进分枝的基因厶同源。以Unigene37948序列为依据，采用RACE技术获得青天葵分枝发育相关基因NfLscDNA全长序列，该序列包含了1191bp的开放阅读框，共编码396个氨基酸。利用NCBIBLASTP功能对NfLs的蛋白功能域进行预测，其归属于GRAS家

6、族。采用sequin软件向GenBank提交NfLscDNA序列及其编码氨基酸序列，获得的登录号为KJ584362。(3)以fl-tubuHn为内参基因，采用实时荧光定量PCR技术，分析NfLs在青天葵不同组织部位(叶片、叶柄、根茎、球茎)中的相对表达量，以及青天葵叶片中NfLs在昼夜节律钟调控下24小时周期内的表达变化。结果表明，NfLs在各组织部位中的表达量高低顺序为叶片>根茎>叶柄>球茎；NfLs在叶片中24小时周期内的表达呈现规律性波动，在暗周期内的表达高于光周期，即晚上的表达量高于白天的。(4)以pRI101AN-DNA为表达载体

7、，通过双酶切反应插入目的基因NfLs，构建了植物双元表达载体pRI101AN．DNA-NfLs，转化农杆菌EHAl05后浸染拟南芥植株，为通过遗传转化验证NfLs在植物分枝发育中的作用奠定基础。本论文从调控青天葵分枝发育的相关基因入手，期望通过增加青天葵地上部分的产量，为解决青天葵资源濒危问题，保证青天葵药用资源的可持续利用提供一个新的思路。关键词：分枝发育；青天葵；厶；表达量：植物双元表达载体CloningandExpressionAnalysisBranchingandDevelopmentGene曲inNerviliafordiiSp

8、ecialty：ChineseMedincineAuthor：LiangLinglingSupervisor：Prof．HeRuiAbstractBranchingisabiol