rho激酶和parp在乳鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡中关系的研究

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1、山东大学硕士学位论文Rho激酶与PARP在乳鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡中关系的研究研究生王倩导师季晓平教授专业内科学(心血管内科)中文摘要背景随着人们生活方式改变和人口老龄化，心血管疾病已经成为威胁人类生命健康的头号杀手，Wlt02008年世界卫生报告显示世界范围内冠心病居人类死亡原因第一位，人们公认最有效的冠心病治疗原则是尽快恢复血液灌注，但近年来各种研究发现心肌缺血后再灌注会加重受损心肌细胞功能及结构的破坏，即缺血再灌注(Ischemiaandreperfusioninjury,I／R)损伤。明确I／R损伤

2、的机制，尽早恢复“罪犯"血管灌注同时减轻再灌注损伤是临床上新的挑战。近来，Rho激酶(RoCK)与多聚ADP核糖聚合酶(PARP)在细胞凋亡信号通路的研究中受到广大科研工作者的关注。Rho激酶与细胞的形态、黏附、转移、增生、分化、信号转导和凋亡等多种生物学行为密切相关。根据发生凋亡的细胞类型及触发凋亡的刺激不同，Rho激酶既可以作为促凋亡因子也可以作为抑制凋亡因子参与细胞凋亡。最新研究表明RhoA／Rho激酶过度表达可以导致心肌细胞肥大，继而通过caspase相关通路导致心肌细胞凋亡。我们前期研究在大鼠心肌缺

3、血再灌注模型证明：缺血再灌注时，Rho激酶明显上调，应用Rho激酶抑制剂可以显著减少心肌梗死面积，降低心肌细胞凋亡率，研究还表明Rho激酶通过JNK／AIF介导的细胞凋亡的信号通路发挥作用。PARP是一个酶家族，具有蛋白修饰和核苷酸聚合作用。对于正常或DNA轻度受损的细胞，PARP帮助修复DNA，维持基因组稳定。但大量或过强的DNA损伤，PARP被过渡激活，造成ATP耗竭，最终细胞因DNA的修复不敌能量的消耗而死亡。研究证明各种刺激可激活caspase家族裂解其底物PARP，从而导致细胞凋l山东大学硕士学位论

4、文亡。我们前期研究表明在大鼠I／R损伤中，PARP激活导致心肌细胞凋亡增加，应用PARP抑制剂对I／R心肌细胞有保护作用。PARP通过JNK来发挥调节AIF的作用。PARP／JNK／AIF信号通路是介导大鼠心脏I／R损伤的一条重要的通路。心肌细胞缺血再灌注时，Rho激酶与PARP都是细胞凋亡相关的细胞因子，两者作用都与caspase细胞凋亡通路以及JNK／AIF信号通路相关，但两者是否存在相互关系，相互关系如何，以及两者通过何种机制导致细胞凋亡目前尚不清楚。本研究拟建立模拟心肌细胞缺血再灌注模型，分别应用Rh

5、o激酶抑制剂盐酸法舒地尔和PARP抑制剂3一AB，测定Rho激酶与PARP在心肌细胞中的表达以及心肌细胞凋亡率，从而明确Rho激酶与PARP在心肌细胞凋亡中的作用以及两者之间的关系。这对阐明缺血再灌注导致细胞凋亡的机制具有重要意义，可能为防治缺血再灌注损伤提供新的治疗靶点。目的(1)观察Rho激酶与PARP在心肌I／R损伤导致细胞凋亡中的作用。(2)探讨Rho激酶与PARP在心肌I／R损伤导致细胞凋亡中的相互关系。方法培养SD大鼠乳鼠心肌细胞，建立缺血再灌注损伤模型。实验分四组：空白对照组：细胞正常培养4天。

6、I／R组：细胞正常培养4天，第5天建立缺血再灌注模型。I／R+3一AB组：细胞正常培养4天，建模前用PARP抑制剂3一AB预处理细胞lh，药物终浓度3mmol／L。I／R+F组：细胞正常培养4天，建模前用Rho-激酶抑制剂盐酸法舒地尔预处理细胞1h，药物终浓度100lamol／L。Westernblot分别检测各组MYPT-I磷酸化水平(P—111fPT一1)及PARP-I蛋白表达量，以mYPT-I磷酸化水平代表Rho激酶的活化程度。应用流式细胞仪Annexin-V／Pl双色法检测各组心肌细胞凋亡率。结果1、

7、心肌细胞形态学观察：接种4—8h心肌细胞开始贴壁生长，24h细胞已全部贴壁，贴壁后为梭形，菱形或多角形，第2天细胞逐渐在瓶底表面铺展，并伸出伪足，形成不规则的星形并相互接触交织成网第3天细胞逐渐连接成片形成致密单层，开始出现单个细胞自发性搏动，频率约45次／min。第4天可形成呈放射状排列的细胞簇，搏动已同步化，约70次／min，收缩明显有力。2山东大学硕士学位论文2、Westernblot检测PARP和Rho激酶蛋白表达趋势：以MYPT-1磷酸化程度来代表Rho激酶活化程度。PARP相对表达量和MYPT—l

8、磷酸化程度分别以PARP和P—M1『PT一1与8-action蛋白电泳条带灰度值的比值表示。缺血lh再灌注3h后，I／R组与对照组相比，Rho激酶活化程度和PARP表达都明显增加(P0．05)，提示PARP