神经退行性疾病相关蛋白翻译后修饰对蛋白功能影响的研究

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1、中国科学技术大学博士学位论文神经退行性疾病相关蛋白的翻译后修饰对蛋白功能影响的研究姓名：费尔康申请学位级别：博士专业：神经生物学指导教师：王光辉20080101摘要神经退行性疾病是一类由脑中特定区域神经元发生退变而引起的慢性进行性神经系统疾病，通常可分为家族遗传型和散发型，在家族遗传型中，主要由于致病基因的突变而引起发病。大部分神经退行性疾病的一个共同的病理特征是致病蛋白会由于降解异常而在胞质、胞核或者胞外形成异常的积聚而形成聚集。约有20％的家族遗传型肌肉萎缩侧索硬化症(FALS)是由于编码铜．锌过氧化物歧化酶(SO

2、Dl)的基因发生突变而引起的，从而造成脑和脊髓运动神经元的选择性丧失引起发病。突变的SODl通常在发病患者的脑和脊髓中通过聚集而形成包涵体，但其致病机制以及突变蛋白的聚集机制至今尚未能明确阐述。另一种神经退行性疾病脊髓小脑共济失调III型(SCA3)／马查多．约瑟夫病(MJD)是由于编码谷氨酰胺的密码子CAG的数量在脚，基因中非正常扩增而引起的一种常染色体显性遗传的多聚谷氨酰胺病。该病的主要病理特征为突变的ataxin．3(肱肋，编码蛋白)在患者易感脑区内的神经元胞核内聚集形成包涵体，但其聚集机制以及致病机制至今也不清

3、楚。神经退行性疾病中聚集的形成与这些致病蛋白的翻译后修饰作用有很大的关系。蛋白质的翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化和SUMO化等，它们可以通过调节底物蛋白的活性、亚细胞器定位、稳定性或者与其它蛋白质的相互作用而达到调节蛋白功能的作用。很多神经退行性疾病相关蛋白如huntingtin、ataxin．1、Q．synuclein、DJ．1和tau等由于SUMO化修饰而对蛋白功能以及疾病发病过程产生影响，也有很多研究表明多聚谷氨酰胺疾病蛋白如huntingtin，ataxin．1和DRPLA的磷酸化对于蛋白的功能以

4、及疾病发生有很重要的影响。因此，蛋白质的翻译后修饰作用与神经退行性疾病之间存在着很大的联系。本论文主要从家族型肌萎缩侧索硬化症(FALS)的致病蛋白SODl的SUMO化和脊髓小脑共济失调III型(SCA3)／马查多一约瑟夫病(MJD)致病蛋白ataxin．3的磷酸化这两方面来探讨蛋白质翻译后修饰对这些神经退行性疾病致病蛋白特性的影响，主要研究结果如下：1．我们运用免疫共沉淀方法和体外SUMO化反应，发现SODl能够被SUMO．1修饰，但是却不能被SUMO．2和SUMO．3修饰。将SODl中第75位赖氨酸这个保守的SUM

5、O修饰位点突变为精氨酸后，SODl则完全不能够被SUMO．1修饰。通过进一步的细胞共转染技术，并用荧光显微镜观察发现经摭要SU醚0．1修饰螽，野生型秘突变型SODl所形成翁憨浆蠹聚集均会增糯，而且SUM0．1能够被撄募至SODl所形成的聚集上，与SODl在缨胞内聚集体上有共定位现象。更进一步通过加入放线菌酮(CHX)以抑制新生蛋白的合成来检测已合成蛋囱的降解速度，证实SUMO．1可以稳定野生型和突变型S0◇l委；不荔降解。这些结果提示，SUMO．{对SOD{在第75德赖氨酸的修饰砸能参与调控SODl的稳定性以及聚集的形

6、成，进丽可能对出SODl突变所引起的FALS的发病产生影响。2．我背j运用GSTpuli．down和免疫共沉淀实验证实激酶GSK3p与ataxin-3能够结合，荠显遴过警。32p括过麓艇P进行体外磷酸纯实验证骧琵常秘扩震的戡axin．3均能被激酶GSK38磷酸化。通过磷酸化位点的点突变实验，我们发现磷酸化的位点是在ataxin一3的第256位丝氨酸上。我们迸一步构建了第256位丝氨酸丧失磷酸化的突变体S256A以及模拟磷酸化的突变体S256D，采用缨脆转染和免疫翠迹检测发现，扩震翡舔aXi静3鲍S256A突变体会影戚蔫

7、分子量的多聚体形成聚集，丽没有突变的扩展的alaxi酗3和其S256D突变体则只是单体。更进一步与分子伴侣Hsp40或Hsp70分别共转染后发现，Hsp70能够抑制扩展的采axin．3的S256A突变体形成聚集。这些结采表鞠激酶GSK38对a鼢‘i融3第256位丝氯酸的磷酸化能蟛调节鑫

8、axi珏13的聚集，该特性可能对SCA3／MJD的发病产生影响。透过以上两个方覆翁研究结果爵竣看毒，蛋自质蕊译后修饰作蔫能够调节神经退行性疾病致病蛋叁的特性，影镌蛋自的聚集，从两可能对予疾病的发瘸产生影响。关键词：享孛经逯行褴疾病蛋鑫质

9、翻泽詹修饰家族型瓿离萎缩侧索硬纯症钢锌过氧化物歧化酶SUM0仡脊髓小脑共济失调{ll型／马查多．约瑟夫瘸ataXin．3肼糖原合成酶激酶磷酸化A8S下交ACtABSTRACTNe狂辩薅ege黼躐i张d蕊asesa慧eh羚曩ie痰so撼e筠e黼s髭by饿ode勰riofa专io疆of‘eenainneurons。Changesint