dna靶向性甲基化酶表达及功能的研究

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1、第四军医大学硕士学位论文DNA靶向性甲基化酶的表达及功能研究姓名：邢克飞申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：药立波;刘新平20070501第四军医大学硕士学位论文缩略语表缩略语英文全称中文全称AAaminoacid氨基酸Ampampicilin氨苄青霉素AOXalcoholoxidase乙醇氧化酶APammoniumpersulfate过硫酸铵bpbasepairs碱基对BSbindingsequence锌指结合序列BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白cDNAcomplementaryDNA互补DNADnmtD

2、NAmethyltransferaseDNA甲基化酶DTTdithiothreitol二硫苏糖醇EBethidiumbromide溴化乙锭E.coliEscherichiacoli大肠杆菌EDTAethylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸（钠盐）G-418geneticin新霉素Hishistindine组氨酸HRPhorseradishperoxidase辣根过氧化物酶HSVherpessimplexvirus单纯疱疹病毒IPTGisopropyl-thio-β-D-galactoside异丙基-β-D-硫代半乳糖

3、苷kDkilodolton千道尔顿LBLuria-Bertani（medium）LB（培养基）-1-第四军医大学硕士学位论文独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其它用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：日期：保护知识产权声

4、明本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容（含电子版，保密内容除外），可以采用影印，缩印或其它复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。论文作者签名：导师签名：日期：-1-第四军医大学硕士学位论文DNA靶向性甲基化酶的表达及功能研究硕士研究生：邢克飞导师：药立波教授第四军医大学生物化学与分子生物学教研室西安710032摘要

5、DNA甲基化、组蛋白修饰和DNA重构等，在不改变DNA原有的碱基配对特性和编码信息基础上，给DNA增加了新的可以遗传的信息，这些修饰称之为表观遗传学修饰。DNA甲基化在高等真核生物的发育分化、基因表达模式的时空调控以及基因组的稳定性中都起着十分关键的作用。DNA甲基化酶包括从头甲基化酶和和维持甲基化酶两种类型；在哺乳动物细胞中，目前已鉴定的从头甲基化酶有Dnmt3a和Dnmt3b，维持甲基化酶为Dnmt1。从头甲基化酶主要向DNA上引入新的甲基化，对底物DNA没有选择性；维持甲基化酶Dnmt1对底物DNA具有选择性，它优先地识别和催化一条链已被甲

6、基化（或称之为半甲基化）的双链DNA，它的主要功能是在DNA复制中将母链的甲基化模式忠实地拷贝到新生链上，这也正是DNA甲基化修饰能够遗传的分子基础。从头甲基化则保证了甲基化的动态性以及对环境的适应性。大量研究表明，DNA甲基化和基因沉默紧密相关，一般情况下，基因启动子区CG岛-3-第四军医大学硕士学位论文的甲基化导致基因表达的关闭，或称为沉默。DNA甲基化引起基因沉默的特性提示：选择性地关闭基因的表达可以通过靶向性甲基化来实现，即将DNA甲基化修饰特异性地引向靶基因的启动子或基因表达调节区的CG岛。随着近年来人造锌指蛋白设计和文库筛选技术的迅速

7、发展，使得获得针对任何特定基因序列的定制化DNA结合蛋白（锌指蛋白）成为现实。现已成功地使用特异性识别HSV早期启动子IE175KVP16结合序列的锌指蛋白引导甲基化酶对该启动子序列的高度甲基化和基因沉默，以及对COS细胞内感染的HSV病毒复制的显著抑制。为了提高靶向性DNA甲基化技术的普遍适用性，我们将探讨用人造锌指蛋白引导靶向性DNA甲基化，这也将是对锌指蛋白技术应用的一个富有创新性的拓展。为了解决上述问题，我们将构建和重组表达人造锌指蛋白引导的靶向性DNA甲基化酶，在体外分析其靶向性甲基化的特异性及效率等性能参数，为细胞内靶向性甲基化提供必

8、要依据；然后以酵母作为模型，通过同源重组将靶基因序列定向整合入酵母基因组，观察和分析靶向性DNA甲基化酶在酵母染色质水平对靶基因的甲基化