epo调节人cd34-%27%2b-造血干细胞cd26的表达及cd26单克隆抗体的制备和鉴定

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1、第三军医大学硕士学位论文EPO调节人CD34<'+>造血干细胞CD26的表达及CD26单克隆抗体的制备和鉴定姓名：范娅涵申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：赵树铭20090501第三军医人学硕士学位论文EPO调节人CD34+造血干细胞CD26的表达及CD26单克隆抗体的制备和鉴定摘要CD26是一种高度保守、分布于多种细胞的II型跨膜糖蛋白，其三级结构已清楚。最初因发现其具有蛋白水解作用，故又称二肽酶Ⅳ(DPPⅣ)。其天然底物种类繁多，在体内具有多种重要的生物学功能。它还是一种细胞膜受体和多种信号转导途径的共刺激分子，参

2、与机体的免疫调节、细胞移行、细胞黏附和细胞凋亡等过程，与多种疾病的发生发展密切相关。CD26抑制剂对治疗自身免疫性疾病及恶性肿瘤等疾病具有重要作用。CD26的酶学活性主要是对N一末端上的“Gly—Pro—Xaa，’和“Ala—Pro—Xaa，’序列水解。基质细胞衍生因子1(stromalcell—derivedfactor1，SDF．1)是CD26的天然底物，其和受体CXCR4的结合参与了细胞迁移、白细胞浸润和器官发育等一系列重要的生理和病理过程。Christopherson的研究组发现粒细胞集落刺激因子(G—CSF)和粒．巨噬细

3、胞集落刺激因子(GM．CSF)可明显上调CD26酶活性，从而下调CD34+造血干细胞的功能性趋化反应，即干细胞的归巢。其作用机理为体内C26具有的蛋白水解酶活性，可阻止SDF—l与CXCR4的结合，抑制CD34+造血干细胞的归巢和定植。CD26抑制剂可能有促进HSC归巢的作用，寻找合适的CD26抑制剂，可能是目前筛选促HSC归巢药物的方向之一。本研究组前期研究表明，植入人造血干细胞的人／猪造血嵌合体体内向红系的分化可能止步于红系的早期阶段，而且之后细胞被猪免疫排斥，没有实现骨髓嵌合。这种情况说明植入的干细胞没有成功归巢和定植于骨髓

4、，或干细胞归巢效率低下。为提高干细胞向骨髓的趋化运动，结合CD26分子的功能特点，本实验主要研究应用于人，猪造血嵌合体中红系定向分化刺激因子一促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)对人CD34+脐血干细胞表面CD26的影响；以及针对CD26酶活性区域制备抑制性CD26单克隆抗体。目的第一部分，观察促红细胞生成素(EP0)对人cD34+脐血干细胞表面CD26表达的影7第三军医人学硕士学位论文响；第二部分，构建CD26原核表达载体诱导表达CD26融合蛋白作为抗原制备CD26酶催化结构域单克隆抗体。方法1．从脐血中分离单

5、个核细胞(MNC)，按MACS—CD34+免疫磁珠分选试剂盒说明书操作分选CD34+细胞。应用流式细胞仪法检测经MACS．CD34+免疫磁珠分选并采用EP0处理后培养的人cD34+脐血干细胞，通过与酶底物反应检测人cD34+脐血造血干细胞表面CD26的表达情况。2．构建原核表达载体，并诱导表达CD26融合蛋白。应用R11-PcR技术以人白细胞mRNA为模板，扩增获取编码CD26催化结构域的基因序列，克隆入原核表达载体PET32a后，转化砚2J感受态细菌，经PTG诱导表达得到his．CD26融合蛋白。亲和层析柱纯化并经W色stemB

6、lot鉴定。3．制备针对CD26酶功能区域的单克隆抗体。用his．CD26融合蛋白作为抗原足挚快速法免疫BALB／C小鼠，采用杂交瘤技术，制备抗CD26单克隆抗体。用ELISA方法筛选分泌抗CD26单克隆抗体的杂交瘤细胞株，采用westemBlot和免疫细胞化学染色方法进行特异性鉴定。同时采用EuSA方法鉴定McAb的Ig亚类，检测McAb的效价并进行McAb结合表位分析。并对其染色体进行分析。结果1．检测EPO处理18h前后脐血干细胞：未加细胞因子组和加入不同浓度细胞因子组的CD34+细胞比例没有显著变化；而与对照组相比，经EP

7、OlooU／111l和EP0200U／111l18h培养后的CD34+脐血造血干细胞群中CD26+细胞比例明显上升，CD26+细胞在cD34+细胞群中的比例随着EPO浓度呈上升趋势。cD34+细胞上CD26酶活性随EPO浓度升高，其活性在100u后呈明显升高(P

8、，溶解包涵体，经过Ni2+螯合亲和层析，纯化后几乎无大于目的片段的杂蛋白，达到动物免疫纯度要求。纯化蛋白WestemBlot鉴定：结果显示纯化后的融合蛋白能与R＆D公司羊抗人CD26多克隆抗体特异性结合且条带清晰。3．成功筛选出四株可分泌特异性Mc