白矾保肝降脂方对非酒精性脂肪肝大鼠疗效机理的实验..研究

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1、实验方法2．3标本采集与方法第12周末次给药后大鼠禁食12小时，以10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，暴露胸腔，心脏取血4ml，低温离心，取血清，-20℃保存；暴露腹腔，摘取肝脏，电子天平称湿重，同时观察肝脏的颜色、质地；于肝右叶中部切取部分肝组织，置于冰块上，称取约0．5mg的肝组织，冰生理盐水冲洗，4。C制备10％组织匀浆，离心取上清，-70℃保存；于肝右叶中部切取约1．5cmx1．5cmX0．2cm肝组织块，置于10％甲醛固定。2．4观察指标与检测方法2．4．1实验过程中，大鼠定期称重、观察大鼠的毛发、反应、食欲及大便等一般情况。2．4．2各组大鼠肝脏指数：(肝

2、湿重／体质量)x100％。2．4．3各组大鼠转氨酶、血脂指标，均在全自动生化分析仪上检测。2．4．4酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中ADP含量，测定步骤如下：实验开始前，所有试剂均平衡至室温。(1)标准品的稀释：配制120ug／L，60ug／L，30ug／L，15ug／L，7．5ug／L的标准品。(具体步骤：略)(2)配制洗涤液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。(3)加样：酶标包被板上前10孔内加标准品，一式二份，每孔50ul；第11孔设空白孔；待测样品孔中依次先加样品稀释液40ul，再加待测样品lOul，轻轻晃动混匀。(4)温育：用封板膜封板后

3、置37℃温育30min。(5)洗涤：揭掉封板膜，弃去液体，甩干，用洗涤液洗涤酶标板5次，拍干。(6)加酶：除空白孔外，每孔加入HRP标记的ADP抗体试剂50ul。(7)温育、洗涤：操作同上。(8)显色：每孔先加入显色剂A50ul，再加入显色剂B50ul，震荡混匀后37"C避光显色15min。(9)终止：每孔加终止液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)。(10)测定：用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。4青岛大学硕士学位论文(11)计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再

4、乘以稀释倍数。2．4．5ELISA法测定肝组织匀浆液中ADP含量，与检测血清ADP含量的步骤相同。2．4．6ELISA法测定血清中TNF—Q含量，测定步骤如下：实验开始前，所有试剂均平衡至室温。(1)标准品的稀释：配制360ng／L，180ng／L，90ng／L，45ng／L，22．5ng／L的标准品。(具体步骤：略)(2)配制洗涤液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。(3)加样：酶标包被板上前lO孔内加标准品，一式二份，每孔50ul；第11孔设空白孔；待测样品孔中依次先加样品稀释液40ul，再加待测样品lOul，轻轻晃动混匀。(4)温育：用封板膜封板后

5、置37℃温育30min。(5)洗涤：揭掉封板膜，弃去液体，甩干，用洗涤液洗涤酶标板5次，拍干。(6)加酶：除空白孔外，每孔加入HRP标记的TNF-0抗体试剂50ul。(7)温育、洗涤：操作同上。(8)显色：每孔先加入显色剂h50ul，再加入显色剂B50ul，震荡混匀后37℃避光显色15min。(9)终止：每孔加终止液50ul，终止反应(此时蓝色立转黄色)。(10)测定：用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。(11)计算：以标准物的浓度为横坐标，0D值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数。2．4

6、．7ELISA法测定肝组织匀浆液中TNF-Q含量，与检测血清TNF-Q含量的步骤相同。2．4．8肝组织病理学观察：(1)石蜡切片①肝组织块置于10％Eft醛溶液中固定12-16h；②常规石蜡包埋；③连续切片，厚度3urn。(2)HE染色：5实验方法①切片置70。C温箱烤片溶蜡30min；②切片浸入二甲苯I、II、III中各5min脱蜡；⑨切片浸入无水乙醇I、II中各3min脱去二甲苯；④切片浸入95％、80％、70％的梯度酒精中各3min，自来水洗imin；⑤苏木精染液中染色5min，自来水洗lmin：⑥1％盐酸酒精分化ls，自来水洗Imin；⑦1％稀氨水返蓝30

7、s，自来水洗imin；⑧伊红染液中染色Imin，自来水洗30s；⑨切片依次浸入705、8096、95％的酒精各Imin；⑩二甲苯I、II、Ⅲ透明各5min，烤干，中性树胶封片。(3)光镜下主要观察肝细胞、肝小叶形态结构、细胞内脂肪变性及小叶、汇管区炎症细胞浸润程度等。2．4．9统计方法采用SPSSl6．0统计软件对结果进行统计学分析。所得实验数据以均数±标准差(叉±s)表示，行正态性检验和方差齐性检验，若正态分布、方差齐性，则采用单因素方差分析(One-WayANOVA)，多组数据间的两两比较采用LSD法；若方差不齐，则采用多重秩和检验。取P

8、异。3实验