土贝母冷浸液体外对hbsag、hbeag的抑制作用研究

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1、土贝母冷浸液体外对HBsAg、HBeAg的抑制作用研究(1遵义医学院微牛物与免疫学实验室贵州遵义563000)(2遵义医学院附属口腔医院口腔外科贵州遵义563000)【摘要】目的：探讨土贝母冷浸液对HepG22.2.15细胞的毒性及其分泌的HBsAg、HBeAg的抑制作用。方法：采用MTT比色法观察受试药物对细胞的毒性，运用酶联免疫吸附(ELISA)试验检测药物对细胞分泌的HBsAg和HBeAg的影响。结果：土贝母冷浸液低于32?g/mL浓度对细胞无明显毒性作用。16?g/mL和8?g/mL的土贝母冷浸液对HepG22.2.15细胞分泌的HBsAg>HBeAg均有抑制作用，对HBe

2、Ag的作用强于对HBsAg的作用，抑制作用在2d时效果最好且抑制率高于阳性药物对照拉米夫定组，但随着用药时间的延长抑制作用反而减弱。结论：土贝母冷浸液对HepG22.2.15细胞分泌的HBsAg、HBeAg具有抑制作用。【关键词】乙型肝炎病毒；HepG22.2.15细胞；土贝母【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】1007-8231(2016)25-0066-02乙型肝炎病毒(HBV)是一种严重威胁人类健康和牛活的嗜肝DNA病毒，据WHO报道，全世界约有1/3的人被HBV感染［1］,而慢性乙肝患者全球约有2.4亿人，目前，已经批准用于治疗慢性乙肝的药物主要有两大类：核昔(

3、酸)类似物(如拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦等)和干扰素类药物［2］。但是西药治疗乙肝存在很多问题，如抗HBV没有特效药，药物的不良反应多，药物依赖性强、价格昂贵等［3］。中药土贝母为葫芦科植物土贝母Bolbostemmapanicultum(Maxim.)Franquer的干燥块茎，具有散结，消肿，解毒的功效［4］。笔者前期研究发现土贝母的主要活性成分土贝母皂昔在体内外对HBV都有一定的抑制作用［5-6］,为进一步研究土贝母抗HBV的作用，木实验观察了土贝母冷浸液体外抗HBV的作用，现报道如下。1•材料与方法1.1材料HepG22.2.15细胞为HBV（adw亚型）全基因转染的人肝

4、癌细胞株、土贝母、拉米夫定（3TC）、MTT、FITC标记的羊抗人・lgG、ELISA试剂盒、HBV・DNA荧光定量PCR检测试剂盒。1.2方法1.2.1土贝母冷浸液制备土贝母粉末（100g）,加入三蒸水（lOOOmL）,放入4°C冰箱，15d后离心收集浸出液，置恒温磁力搅拌器上浓缩至100mL,浓度相当于每毫升含lg生药量，过滤除菌，分装，置・20°C保存备用。临用前采用2%DMEM维持液配制成实验浓度。1.2.2细胞培养及实验分组用10%DMEM完全培养液培养HepG22.2.15细胞，5%CO2、37°C孵箱中培养。0.25%胰酶消化生长状况良好的HepG22.2.15细胞，

5、配置成1×105个细胞/mL,分别接种于96孔、24孔培养板中，待细胞贴壁后换含不同浓度（4、8、16、32?g/mL）土贝母冷浸液，分别培养2天、4天、8天。每24h换液一次，收集上清保存・20°C备测。同吋设细胞对照组及阳性药物拉米夫定组，空H孔不加细胞,只加培养液。1.2.3MTT比色法观察药物对细胞的毒性每孔加入10?LMTT溶液（5mg/mL）,在37°C、5%CO2培养箱中孵育4h,弃去上清液，每孔加入150?LDMSO,振荡器上振荡5〜lOmin,用酶标仪在450nm波长下测定每孔的光密度（OD）值，计算细胞存活率。细胞存活率二（实验孔OD值/对照孔OD值

6、）×100%o1.2.4ELISA法检测HBsAg、HBeAg的量生长良好的HepG22.2.15细胞以7000个/mL的浓度接种于96孔板，每孔100?Lo第二天弃去上清，实验组中分别加入土贝母冷浸液32、16、8?g/mL,阳性对照3TC组50?g/mL；阴性对照组加入维持液，每孔200?L,每组6个复孔。2、4、8d收集细胞上清液于・20°C保存，按试剂盒说明书分别检测HBsAg、HBeAgo1.3统计学处理数据以（x-±s）表示，应用SPSS17.0软件处理数据，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05差异有统计学意义。2•结果2.1MTT法测定土

7、贝母冷浸液对细胞的毒性实验表明，在2、4、8d中，土贝母冷浸液在4?g/mL〜32?g/mL浓度之间毒性随着浓度的升高而升高，细胞存活率随着浓度的升高而降低，高浓度组在倒置显微镜下可见细胞成空泡、肿胀，其至破裂。(表1)2.2土贝母冷浸液对HepG22.2.15细胞分泌的HBsAg的影响实验提示：随着时间延长，抑制作用减弱。(表2)(表3)3.讨论中药汤剂是液体复合分散体系，是我国应用最早、最多的一种剂型，以水为溶剂，制作方便，价廉便宜，起效又较为迅速，在中医临床仍然