女性生殖道感染致精子dna损伤及胚胎停育关系探究

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1、女性生殖道感染致精子DNA损伤及胚胎停育关系探究摘要目的：研究女性生殖道感染致精子DNA损伤与胚胎停育的关系。方法：分别用彗星电泳方法择定胚胎停育女性（研究组）和正常胚胎发育女性（对照组）生殖道分泌物孵育后精子。结果：研究组彗星细胞平均尾长和1,2,3,4级彗星细胞的百分率均较对照组相对应的值显著性增高。结论：早期胚胎停育与女性生殖道感染引起的精子DNA损伤相关。关键词胚胎停育生殖道感染DNA损伤各种原因导致的人类妊娠质量的下降以及人们对高质量妊娠的期盼已经成为热点问题。已有大量的实验研究证实精子在男性生殖器发育成熟过程中如遭受射线、化学毒性物质

2、、病原微生物等攻击后可致不育或受精后早期胚胎停育[1〜5]。在近年来的临床工作中，我们发现部分胚胎停育女性伴随较严重的生殖道感染。为了研究这些感染造成的不良阴道和宫颈管环境是否会造成精子DNA损伤而致早期胚胎停育，并评价女性生殖道分泌物对精子DNA损伤的检测在预测不良妊娠中的价值，选择合并中、重度生殖道感染（依据于症状、妇科检查及实验室检查）的孕早期胚胎停育女性31例与早期正常胚胎发育女性30例作为对照，采集阴道穹窿和颈管分泌物孵育质量指标正常的精进行孵育后精子彗星电泳分析。现将方法和结果报告如下，并进行相应分析讨论。资料与方法一般资料：研究组3

3、1例为妇科检查和实验室检查合并有阴道和宫颈感染，配偶精液常规分析各质量指标正常,孕期月经周期25〜35天，估计受孕时间为50〜90天，年龄24〜32岁，临床及实验室、B超检查证实胚胎停止发育。对照组30例选择围孕期月经周期25〜35天，估计受孕时间50〜70天，B超检查早期胚胎发育正常，因计划外受孕要求终止妊娠的女性，年龄21〜33岁。正常精液由接受围孕期生殖健康检查、精液分析质量指标正常，年龄25〜30岁的健康男性提供。31例组研究组女性均未做过孕前生殖健康方面的检查。孕早期妇查合并中、重度阴道炎和或宫颈炎体征。实验室阴道后穹窿和宫颈管分泌物病

4、原体检查16例复杂假丝酵母菌感染，4例阴道毛滴虫感染，8例细菌性阴道病，2衣原体感染，1例淋球菌感染。对照组30例女性阴道和宫颈妇检及分泌物实验室检查无感染的症像。试剂与仪器：低熔点与正常熔点凝胶，生命技术公司产品。其他试剂均为Sigma公司产品。NikonAFX-AII型荧光显微镜为日本Nikon公司产品。阴道分泌物和宫颈黏液的采集与精子的孵育：用无菌吸管采集阴道和宫颈黏液约2ml置无菌试管于371水浴箱中。精液样本3〜5天禁欲后用自慰的方法收集于无菌容器中，371水浴箱中温育20分钟使其液化，根据文献［4］做精液常规质量分析，取2ml质量指标

5、正常的精液，各分lml放置于研究组和对照组阴道穹窿和宫颈分泌物中，37匸水浴箱温育30分钟后进行彗星电泳分析［6］。精子洗涤和凝胶设置：首先，待检测精子用Phosphate-bufferedsaline(PBS)洗涤(1500r/分，10分钟)3次，然后以2X106cells/ml的浓度悬浮在PBS中。在冰冻玻片上铺上100p1075%的正常熔点凝胶，在室温下静置5分钟使得凝胶凝固。8P1精子细胞悬液与72ul075%低熔点凝胶充分混合后铺在第一层凝胶上，4°C静置8分钟使其凝固，100U1075%低熔点凝胶铺在第二层凝胶上，41再静置8分钟。细

6、胞裂解与DNA解旋玻片在含有25mMNaCl,100mMNa2~EDTA,lOmMTris,1%sodiumlaurylsarcosine,1%TritonXT00(pHlO)的裂解液中4°C条件下作用1小时以裂解精子细胞。然后，玻片浸泡在包含25mMNaCl,5mMTris,005%sodiumlaurylsarcosine,lOug/mlRNase(pH74)的溶液中37「C条件下作用4小时。最后，玻片在含有25mMNaCl,5mMTris,005%sodiumlaurylsarcosine,200ug/mlproteinaseK(pH74)

7、的溶液中，37£条件下作用15小时。电泳、中和、染色玻片在含有300mMsodiumacetateandlOOmMTris（pHlO）电解液中4。（2条件下平衡20分钟。然后，在12V（046V/cm）、100mA、4工条件下电泳60分钟。最后，再在含有04MTris-HCl的缓冲液（pH74）中4°C中和5分钟，用45u1ofethidiumbromide（15ug/ml）染色、封片。镜检和图象分析：使用目镜测微尺测量每个精子细胞核的彗星尾长，并根据彗星尾部DNA的含量将精子细胞核损伤程度分为5级：①0级：彗星尾部荧光强度小于总强度的5%,无损

8、伤（核基本完整）；②1级：5%〜20%,轻度损伤；③2级：20%〜40%,中度损伤；④3级：40%〜95%,重度损伤；⑤4级：＞95%,