从动物血液提取sod的工艺流程及技术

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1、从动物血液提取SOD的工艺流程及技术SOD（过氧化物岐化酶，Superoxidedismutase）存在于动物、植物及微生物中的金属酶，主要分为以下几种类型（如表）。表S0D的分类及存在类表SOD的分类及存在类型存柱分子量颜色粗成Cu・Zu・SOD真核细胞的细胞浆内32000蓝绿色由2个亚基组成，每个亚基含1个铜和1个锌Ff-SOD只存在于真核细胞内38000«色由2个亚基组成，每个亚基各含1个铁Md-SOD原核细胞内4000粉红色由2个亚基组成，每个亚基各含1个猛真核细胞线粒体S000粉红色由4个亚基组成，每个亚基各含1

2、个镒Co・Zd-SOD牛肝中SOD用于延缓人体衰老，防止色素沉着，并治疗慢性多发性关节炎等症，也被广泛地应用于生产日用化工品，如s0D化妆护肤品，对抗衰老、去除脸面雀斑等有明显的效果。随着日用化工产品的发展及SOD在临床上的应用，SOD的需求量越来越大。我国动物血源丰富，牛血、猪血的价格较低，生产S0DX艺简单。所以，用牛血、猪血来提取S0D具有较大的发展前途。现介绍用牛血、猪血来提取SOD的方法。1、工艺流程l血浆（用十凝血幽樫取）新鲜动物血恥I■血球半一离心液兰―上清液鲁―沉淀物一►上清液器»沉淀物上柱•梢制逊一洗脱液

3、逾・透析敲爰绘車眷SOD精制品（成品｝2、技术操作要点（1）分离:新鲜动物血（牛血或猪血）收集后,用纱布滤出血液,以除去血液中的杂毛及其它异物，然后加入柠檬酸钠（一般10kg血液中加380mg柠檬酸钠），充分搅拌均匀后以3000转/分的速度（以下如同）离心15〜20分钟，收集血球，血浆可用于凝血酶的提取。（2）去除血红蛋白：用0.9%氯化钠溶液离心洗涤已收集的血球三次，每次氯化钠溶液用量为血球体积的2倍为宜。往已离心洗涤的血球中加入等体积的去离子水（或蒸憎水）,在温度2°C左右的条件下剧烈搅拌30〜40分钟,并在同温下放置

4、24小时左右。因为牛血SOD对热较稳定，但猪血sOD对热敏感，所以在分离或提取整个过程中温度控制在0〜4°C,时间不要超过3天。若因其它原因，不能及时处理时，可以冷冻保存溶血溶液，并不影响其SOD的活力。（3）萃取：往溶血溶液中分别缓慢加入溶血的血球0.25-0.3倍体积的95%冷乙醇和0.15〜0.2倍体积的冷氯仿，充分搅拌30分钟，静置30分钟，然后进行离心分离，收集上清液。此时应注意有机溶剂的适当比例，才能有效地分离去除蛋口质等杂质，同时必须控制温度在2°C左右（不要超过5°C）,才能达到最佳分离效果。（4）沉淀：向

5、上述上清液中加入1〜2倍体积的冷丙酮，充分搅拌均匀，此时可产生大量口色沉淀，静置30分钟，然后进行离心分离，收集沉淀物。再用1・5倍的冷丙酮洗涤沉淀物，在温度2°C的条件下静置24小时左右。再进行离心分离，收集沉淀物。并把上层丙酮液合并在一起，回收丙酮，此丙酮可以重新使用。(5)热变:把PH值为7.6-7.8,浓度为2.5微摩尔/升的K2HP04一一KH2P04缓冲溶液加入到上述沉淀中，并在温度60°CF搅拌30分钟，然后迅速冷却到20°C,离心分离收集上清液。因为牛血SOD在pH值5.3-9.5,猪血S0D在pH值7.6

6、-9.0范围内较稳定，所以必须掌握SOD的最佳pHo(6)洗涤：向上清液中加入等体积的温度为2°C的丙酮，充分搅拌，并静置30分钟，再进行离心分离，收集沉淀物。此沉淀物中加入K2HP04——KH2P04缓冲溶液，充分搅拌溶解，离心分离，收集上清液。(7)精制：柱长40cm,柱内径3cm的柱中装入已处理的二乙胺乙基葡萄聚糖凝胶离子交换剂(DEAE——SephadexA——50),用pH值为7.7,浓度为2.5微摩尔/升的K2HP04——KH2P04缓冲溶液上柱，当流出液的PH值为7.6时，将上述上清液上柱，用PH值为7.6的

7、缓冲溶液进行梯度洗脱，收集具有SOD的活性峰。因为PH值能控制SOD分子的带电状态，盐浓度能控制结合键的强弱，所以上柱精制分离时应注意PH值和盐浓度。(5)干燥：将洗脱液装入透析袋内，并在去离子水中进行透析，将透析液进行超滤浓缩，冷冻干燥可得s0D精制品。把S0D精制品装入棕色瓶内，压紧瓶盖，放在通风、避光、干燥的地方保存。