乳和乳制品中β―内酰胺酶检验方法探究韩凤霞

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1、乳和乳制品中B—内酰胺酶检验方法探究韩凤霞摘要：微生物法作为国标方法检测乳及乳制品中B-内酰胺酶，存在假阳性极高的现象，现有碘量法、酸量法、色谱法、光谱法、试剂盒免疫法，均存在优缺点，故均需要更为科学的论证，目前探究更好的方法针对市场上存在的“无抗奶”的检测尤为重要。关键词：乳及乳制品B-内酰胺酶微生物抑制法色谱法碘量法酸量法光谱法试剂盒免疫法食品安全问题层次不穷的当今社会，抗生素残留问题成为影响乳及乳制品安全的重要因素之一。采用B-内酰胺类药物治疗牛乳腺炎、长期喂饲抗生素的饲料，这两种途径是导致牛奶中常见抗生素的残留［1］。饮用含抗生素的牛奶可能导致饮用者对抗生素的过敏反应

2、，或因长期接触抗生素而导致耐药，因此，世界各国都严格限定原料乳中抗生素最大残留限量［2］。2009年2月我国卫生部等九部门组成的全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治领导小组公布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单（第二批）》中列入乳与乳制品掩蔽抗生素的违法添加的非食用物质。利益的驱使，使得人们人为的使用一些生物制剂（解抗剂）的方法去降解牛乳中的残留抗生素，造成这种人造的'‘无抗奶”的产生。卫生部确定的原料乳及液态乳中B-内酰胺酶的检测方法为微生物抑制法-杯碟法，该方法经过多个检测机构的验证得出的结果是会导致假阳性率较高。目前，全世界还没有一种比较有效的检测方法

3、、标准能快速、准确及科学、稳定地检测乳及乳制品中B-内酰胺酶。1、B-内酰胺酶的概念、理化性质、来源及添加在乳及乳制品中对人类的危害1.1概念能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基头胞烷酸(7-ACA)及其N-酰基衍生物分子中B-内酰胺环及内酰胺键的灭活酶，即能裂解青霉素和头砲菌素类等的有内酰胺环的抗生素，使它们灭活的水解酶，称为B-内酰胺酶，俗称抗生素分解剂或解抗剂，按不同的抗生素大致可分为青霉素酶及头砲菌毒酶、头胞菌素酶三种[3]。1.2理化性质纯化的B-内酰胺酶的分子量(MW)为14000〜4900014],等电位(pl)为4.3〜10.5[5][6],根据

4、分子结构中氨基酸序列差异，将B-内酰胺酶分成A、B、C、D四种类型。1.3来源常见的产B-内酰胺酶的菌株有金黄色葡萄球菌、肠球菌、大肠埃希氏菌、肺炎可雷伯杆菌、肠杆菌属、弗氏柠檬酸杆菌、沙雷菌属、普罗威登斯菌属、铜绿假单胞菌。1.4危害产生B-内酰胺酶是革兰氏阴性杆菌对B-内酰胺类抗生素耐药是最重要机制［7］。该酶的使用可以掩盖牛奶中实际含有的抗生素，导致青霉素、头胞菌素等抗生素类药物耐药性增高，从而大大降低了人们抵抗传染病的能力。牛奶中B-内酰胺酶可能来自：一、外源（人为添加到牛奶里），二、内源（牛奶中有关细菌产生）。2、目前牛奶中B-内酰胺酶的检测方法1.1微生物抑制法-

5、杯碟法利用克拉维酸、舒巴坦的特异性抑制B-内酰胺酶的特点做细菌培养，通过测量抑菌圈的大小得出结果。微生物抑制法-杯碟法优点：不需特殊试剂，容易操作,结果容易判断，对具良好抗菌活性的抗生素灵敏度好，检出限低。缺点：特异性差，不能用于酶动力学分析，培养时间长,假阳性现象多。需要考虑的因素多（培养基的制备、牛乳抗生素分解剂活性分析、青霉素G浓度的选择、舒巴坦浓度的选择、灭菌条件对酶活力残留的影响，贮藏条件对酶活力残留的影响等等）⑻。2.2碘量法根据青霉素或头胞菌素经B-内酰胺酶作用产生裂解酸与碘结合，可使蓝色的碘淀粉复合物褪色的原理设计的方法，从而判断牛奶中是否掺有抗生素解抗剂，P

6、erret［9］最早建立此法。碘量法优点：试剂易得、简便易行、再现性好、操作时间短，但假阳性和假阴性现象明显，需作酶阴阳性对照。缺点：对反映时间要求严格、需要高浓度底物、灵敏度差、检出限高、不能用于酶动力学分析等等缺点，不能广泛应用。2.3酸量法根据青霉素或头胞菌素经内酰胺酶作用产生裂解酸引起的pH变化，用碱液滴定定量。该法最先由SazElO］建立用于金黄色葡萄球菌胞外酶的测定，后来发展了许多方法。利用指示剂作终点判定，范围较宽，目前，有用酸度计法快速检测牛奶中残留的B-内酰胺酶［11］,酸度计法由于pH计灵敏度较髙，易受到声波、温度、水质和振动等诸多因素的干扰。酸量法优点：

7、简单易操作、重现性好、灵敏度高、结果稳定性好、假阳性和阴性结果少。缺点：操作复杂、不适用于头砲菌素的测定、不能用于酶动力学分析。2.4色谱法-高效液相色谱法（间接法和直接法）2.4.1间接法利用B-内酰胺酶能够酶解青霉素原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，根据青霉素浓度的变化，利用高效液相色谱紫外检测器分析，判断牛奶中是否添加B-内酰胺酶。优点：该方法只能定性给出结论；缺点：无法确切给出定量结果、样品处理相对复杂、费时。2.4.2直接法利用牛奶中青霉素钾在B-内酰胺酶作用下生成青霉囉哇酸钾，并伴随生成少量