玉米螟高毒力生防菌株筛选与发酵工艺研究

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1、玉米螟高毒力生防菌株筛选与发酵工艺研究　　摘要：以玉米螟（Pyraustanubilalis）为对象筛选出一株高毒力生防菌株苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）NBIC380。通过培养基优化，获得适宜的培养基配方D。补料发酵研究的结果表明，固定氮源浓度为80g/L，发酵前期补料效果明显，补料速率为根据发酵不同阶段进行调整，可以取得更好的发酵结果，有利于提高产量，降低生产成本。　　关键词：玉米螟（Pyraustanubilalis）；生防菌株；发酵　　中图分类号：S433.4；Q813.1文献标

2、识码：A文章编号：0439-8114（2015）24-6248-04　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.039　　Abstract：AbiocontrolstrainBacillusthuringiensisNBIC380withhighvirulencetoPyraustanubilaliswasobtained.Accordingtothisstrain，appropriatemediaformulationsDwasobtainedbymediumoptimi

3、zation.Fed-batchfermentationexperimentsshowedfermentationpre-feedingeffectwasobviousbyusing80g/Lnitrogenconcentration.Feedingratewasadjustedaccordingtothedifferentstagesoffermentation.Thisstrategycouldimproveproductionandreduceproductioncosts.　　Keywords：Pyraust

4、anubilalis；biocontrolstrain；fermentation7　　玉米螟（Pyraustanubilalis）是世界性害虫[1]，在中国各玉米产区均有发生，使用化学防治带来的农药残留危及食品安全，尤其是随着鲜食玉米消费量的不断上升，使得问题更是突出。20世纪60年代，国内就开始尝试采用Bt制剂拌土或细砂后灌心，或者使用飞机喷雾防治玉米螟低龄幼虫[2，3]。市面上多数Bt制剂产品对玉米螟幼虫都有一定的效果，但没有以玉米螟为靶标进行筛选的专用菌种[4，5]。为此，本研究旨在建立以玉米螟初孵幼虫为靶标的

5、高毒力菌株筛选体系，并开展其工程化技术研究开发[6，7]。　　1材料与方法　　1.1材料　　菌种：Bt菌种1～15号，均由湖北省生物农药工程研究中心自行分离并保存，均可用于Bt产品生产。对照菌株MP-18，由湖北康欣农用药业有限公司提供。　　供试虫：玉米螟采自黑龙江省，由湖北省生物农药工程研究中心养虫室保种并培养，提供供试初孵幼虫。　　培养基A、B、C、D均为湖北康欣农用药业有限公司筛选优化的Bt生产用培养基。分批发酵培养基：碳源浓度为25g/L，氮源浓度为55g/L，pH6.5～7.0。补料发酵培养基起始碳源浓度1

6、5g/L，氮源浓度80g/L，pH6.5～7.0。　　1.2方法　　1.2.1混菌法参照国家标准GB/T19567.1-2004中棉铃虫生物测定方法进行。7　　1.2.2分批发酵方法从斜面上接一环菌入摇瓶种子培养基中，28℃，200r/min下培养至对数期后期，以5%接种量接入400L种子发酵罐中，装料240L，罐压0.02MPa，在发酵过程中通过空气流量及搅拌转速对溶氧进行控制，pH不予控制。镜检观察，种子长到合适的阶段后，压入5t罐继续发酵培养，待晶体形成并脱落1%～5%，放罐。　　1.2.3补料发酵方法前期的补

7、料发酵在500mL三角瓶中进行。小试在20L不锈钢自动发酵罐中进行补料发酵。中试在生产车间5000L发酵罐中进行补料发酵。小试发酵过程中各种数据电脑监控记录，pH、溶氧由pH电极和溶氧电极在线检测，搅拌转速在100～500r/min内无级调速，投料体积12L；培养基121℃灭菌30min，通气量2m3/h。　　摇瓶补料发酵：氮源一次添加，补加碳源为液化淀粉，维持总碳源浓度为30g/L，发酵12h补加剩余碳源，培养至孢晶20%分离时下摇床。　　20L及5000L发酵罐补料发酵：根据pH变化确定补料时机，当淀粉液化完成、

8、pH即将回升、有机酸等中间代谢积累物开始快速被利用时，开始补料。此时细胞对氧的需求加大，生长速度加快。补料开始时，降低培养温度，由起始31℃降为28℃培养，降低生长速率，缓解菌体急剧生长时供氧与需氧的矛盾，延长对数期；根据溶氧确定转速的调控，起始转速为300r/min，当溶氧急剧下降时，将转速调为500r/min；根据还原糖浓度确定补料速度，采