对褐飞虱高毒力的真菌菌株筛选及其应用研究

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1、安徽农业大学博士学位论文对褐飞虱高毒力的真菌菌株筛选及其应用研究姓名：李茂业申请学位级别：博士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：林华峰201206摘要褐飞虱朋地阳n，口缸如僭B凇St乱是我国及东南亚地区一种远距离迁飞性水稻重要害虫。为了寻求对该虫生物防治的新途径，本论文在既有资料的基础上，进一步筛选对褐飞虱高毒力的真菌菌株，系统研究了所得高毒力黄绿绿僵菌施细砌讶删加VDw删匆(Mf)菌株的生物学特性、对褐飞虱不同虫态的毒力以及致病机理，研制了该菌株乳悬剂剂型，并对黄绿绿僵菌(Mf)菌株的固相发酵培养基组分的配方进行了优化，为防治褐飞虱真菌杀虫剂的开发与规模化生

2、产提供有价值的技术资料。本研究主要获得以下结果：1、从褐飞虱Ⅳ玩妒刀s罹病虫体上新分离出的一种黄绿绿僵菌菌株M．触vD订盹如(Mf)，与实验室保存的黄绿绿僵菌、金龟子绿僵菌和白僵菌3种菌种5个菌株作对比，研究了在SDAY和PDA培养基上的培养性状，并测定了它们对褐飞虱成虫的毒力。结果表明：在SDAY培养基上，6个菌株菌落特征差异明显，Mf菌株菌落直径增长量最大，产孢量最高，分别为2．59mm，17．34×107孢子／cm2。与其它菌株相比差异显著。Mf菌株在SDAY培养基上生生长优于PDA，Mf菌株对褐飞虱成虫具有很强的毒力，以1．0×108孢子／mL的孢子液

3、接种到褐飞虱成虫体表上，累积校正死亡率达83．8％，LT50为4．47d，致死率明显高于其他真菌。2、用分子生物学主方法对褐飞虱成虫高毒力真菌菌株进行了鉴定。采用氯化苄法、CTAB法以及裂解液法分别提取了该菌的基因组DNA；以ITSl和ITS4为绿僵菌通用引物，对供试菌株的rDNAITS序列进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测和序列分析，并在核酸序列数据库中进行同源序列对比。实验结果表明裂解液法提取的该种绿僵菌的基因组DNA纯度高且质量好，氯化苄法次之，CTAB法不适合提取此菌的基因组DNA；分子鉴定结果显示该菌为绿僵菌属黄绿绿僵菌(M．肋VDv删沈)。明确侵染

4、褐飞虱的绿僵菌种类，进而掌握其生物学征和对寄主的致病性。3、对新分离鉴定黄绿绿僵菌Mf82菌株，将其与实验室保存的8株绿僵菌Mspp．一起，分别测定其对褐飞虱成虫毒力和几丁质酶活力，并用扫描电镜观察了Mf82菌株侵入昆虫表皮的过程和体表的形态变化，进而分析侵入能力与几丁质酶的相关性。结果表明：菌株Mf82累计校正死亡率和几丁质酶活力均最高，为82．1％和9．78U／mg，与其他菌株差异显著。同时，扫描电镜照片显示Mf82分生孢子既可以由褐飞虱体壁节间膜和凹陷处侵入，还可以从含几丁质较多的胸部背板侵入，可见筛选的Mf82菌株对褐飞虱成虫致病力强。比较9株绿僵菌菌

5、株菌落生长速度、产孢初始时间、产孢量和萌发率显示，Mf82菌株具有生长速度快、产孢初始时间短、萌发率高和产孢量大等优点。4、利用黄绿绿僵菌M加阳1，f砒把82菌株五种浓度5296．5368、1055—1121、585．623、126．144和22．31孢子／mm2侵染不同龄期褐飞虱成虫和若虫并以1100孢子／mIn2孢子悬浮液侵染褐飞虱怀卵雌成虫、雌成虫、雄成虫和不同龄期卵。结果表明：其不同浓度孢子液对褐飞虱3个发育阶段有不同程度的致病力，毒力大小顺序为成虫>高龄若虫>低龄若虫。同时，Mf82菌株对不同性别褐飞虱成虫的敏感性顺序为怀卵雌成虫>雌成虫>雄成虫。黄

6、绿绿僵菌孢子液对各处理稻株褐飞虱产卵痕部位、卵粒均有侵染作用，10d侵染率分别为66．7％和51．2％，卵龄越低，侵染效果越好，卵龄为0．5d时侵染率最高。本研究表明黄绿绿僵菌Mf82菌株对褐飞虱成虫、若虫和卵均有较强的致病性，5、利用扫描电镜观察了黄绿绿僵菌M．肋Ⅷ1，f订沈菌株分生孢子对褐飞虱的侵染过程。结果表明：分生孢子多分布在褐飞虱节间膜、体表的褶皱凹陷等部位，主要以芽管或产生附着胞入侵，然后在体表长出菌丝和产孢。菌体进入寄主血腔后，利用体腔内营养大量增殖、扩散并侵染褐飞虱卵巢中的卵块。侵染卵块的菌丝虽被体液包裹但依然能继续生长，使卵粒失活，抑制害虫下

7、代的数量。通过体表及体内的侵染过程，可直观地表现黄绿绿僵茵对褐飞虱的侵染能力和侵入方式，为评价该菌的杀虫作用和应用前景提供了证据。6、用新分离出的黄绿绿僵菌肱伽阳v埘沈(Mf82)菌株与实验室保存的黄绿绿僵菌、金龟子绿僵菌和白僵菌3种菌种9个菌株作对比，测定了它们的悬乳剂对褐飞虱成虫的毒力。结果表明：Mf82菌株对褐飞虱成虫的毒力最高，以1．0×108个孢子／mL的孢子悬乳剂喷雾接种到褐飞虱成虫体表上，累积死亡率高达81．7％，LT50为4．6d，致病效果显著高于其他受测菌株。在此基础上研制了黄绿绿僵菌悬乳剂，并研究了其对褐飞虱的致病力。结果表明：随着黄绿绿僵

8、菌浓度的增加，褐飞虱的累计死亡率增加，