柴达木盆地梭梭lea基因的扩增及序列分析

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1、柴达木盆地梭梭LEA基因的扩增及序列分析　　摘要：为发掘梭梭（Haloxylonammodendron）抗逆相关基因，以柴达木盆地梭梭的同化枝为材料，扩增其LEA基因并进行了序列测定与分析。结果表明，所得柴达木盆地梭梭的LEA基因碱基数为234bp，其中A碱基70个，T碱基52个，G碱基59个，C碱基53个；氨基酸序列分析表明，所得LEA基因片段编码78个氨基酸，其中强碱性氨基酸有12个，强酸性氨基酸有6个，疏水性氨基酸有34个，亲水性氨基酸有26个。　　关键词：梭梭（Haloxyolonammodendron）；LEA基因；扩增

2、；序列分析　　中图分类号：Q781文献标识码：A文章编号：0439-8114（2016）09-2383-03　　梭梭（Haloxylonammodendron）为藜科（Chenopo-diaceae）梭梭属（Haloxylon5Bunge）多年生小乔木。主要分布在中国新疆、青海、内蒙古、甘肃的半荒漠和荒漠地区。柴达木盆地气候高寒干燥，蒸发量大降水量小，盆地沙漠化和盐渍化严重。梭梭作为柴达木盆地早生、盐生荒漠植被的主体，长期生长于干旱、盐碱的环境中，具有很强的抗旱、耐盐碱性，因而梭梭响应干旱、盐等非生物胁迫的生理生化机制研究备受重视

3、。胚胎发育晚期丰富蛋白（LEA）是在棉花胚胎发育后期的子叶中大量累积的一类蛋白质，因而被称为胚胎发育晚期丰富蛋白，现已证明LEA蛋白不仅广泛存在于植物中，也存在于细菌和无脊椎动物中，Dure等根据氨基酸序列或亲水性结合每个LEA家族特有的保守序列，将LEA蛋白划分为6个家族，Battaglia等后来依据棉花中已获得的LEA蛋白氨基酸序列的同源性将LEA蛋白分为七类。大量的研究表明，LEA参与了植物对干旱、盐、低温等环境胁迫的响应，LEA蛋白可被各种胁迫条件诱导而大量产生，在植物脱水耐受中发挥重要作用。目前，有关梭梭LEA基因的研究

4、鲜见报道。本试验对柴达木盆地梭梭进行LEA基因克隆的基础上，下一步对LEA基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析，以期为LEA基因的表达特性及功能研究奠定基础。　　1材料与方法　　供试梭梭的种子采自青海省柴达木盆地，实验室育苗后取同化枝进行总RNA的提取。RNA提取试剂盒为北京艾德来生物技术有限公司产品，Ex-TaqDNA聚合酶、反转录酶、DL2000DNAMarker购自宝生物工程（大连）有限公司。　　参照试剂盒说明提取梭梭总RNA，根据已发表的LEA基因序列设计扩增引物，由大连宝生物工程有限公司合成，预期目的片段长度为234b

5、p。引物为LEA-F（5'-ATGGCTCGCTCTATCTCTAACG-3’）、LEA-R（5’-AGCCGCATGATFAGCAGG-3’）。RT-PCR过程为取梭梭总RNA5μL，NHX-R4μL，DNTPMixture3μL，RNase-FreeddH2O3μL，70℃预热5min，立即冰浴2min，加入5倍的反转录缓冲液4μL，反转录酶1μL，置于42℃水浴50min，95℃5min，补加RNase-FreeddH2O至总体积为50μL。PCR扩增程序：94℃1min，55℃1min。72℃1min，35个循环，72℃5

6、10min。将扩增正确的PCR产物送交生物公司进行序列测定，应用DNASTAR软件对LEA基因序列进行分析，用Blast程序进行序列同源性分析。　　2结果与分析　　2.1梭梭总RNA提取　　提取的梭梭总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测表明（图1），RNA所在泳道28S和18S条带清晰，28S为18S的两倍，总RNA质量可以满足后续试验的要求。　　2.2梭梭LEA基因PCR扩增结果　　将LEA基因的PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果表明（图2）LEA基因所在泳道出现目的条带。大小与预期的234bD长度相符。　　2.3LEA基因

7、核苷酸序列和氨基酸序列分析　　2.3.1核苷酸序列和氨基酸序列分析　　梭梭LEA基因核苷酸序列经DNASTAR软件分析后，结果表明（表1、表2），LEA基因核苷酸序列长度为234bp，整个基因序列中A+T的含量高于G+C的含量，氨基酸序列长度为78aa，分子量为8301.34Da，等电点为10.15。各类氨基酸中碱性和酸性氨基酸的含量分别为15.4%和7.7%，疏水性和亲水性氨基酸的含量分别为43.6%和33.3%。　　2.3.2梭梭LEA基因与参考基因核苷酸序列和氨基酸序列比较将获得的梭梭LEA基因与Genebank中登录的梭梭

8、（Haloxylonaammodendron，JQ277729.1）、海马齿（Sesuviumportulacastrum，HQ427488.1）、甜菜（Betavulgarissubsp，Vulgaris，LOC104898925）、长叶红沙（R