舌鳞癌干细胞相关差异表达cdna文库的鉴定与分析

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1、舌鳞癌干细胞相关差异表达cDNA文库的鉴定与分析邹波，季平，孙守娟，漆小娟（400015重庆，重庆医科大学附属口腔医院颌面外科）[摘要]目的对构建的舌鳞癌干细胞相关差异表达cDNA文库进行初步克隆、鉴定及分析。方法将差异表达cDNA文库中的cDNA片段转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选，正反向文库各随机挑取120个白色克隆，菌落PCR鉴定有无插入片段，对挑取的阳性克隆进行测序以获得差异表达基因片段的序列。将测序所得序列提交GenBank进行Blast同源性分析。利用Pubmed数据库检索已报道的与干细胞相关的差异基因并进行生物信息学分析。结果PCR鉴定显示挑

2、取的克隆均为阳性克隆，测序获得224个EST片段，序列长度在200～800bp之间。经同源性分析得到62个同源基因，其中9个已有相关文献报道与干细胞生物特性相关，可归类于细胞分化调节、低氧应答、细胞凋亡调节等。结论对前期构建的干细胞相关差异表达cDNA文库进行克隆分析得到一些干细胞相关基因。[关键词]舌鳞癌；干细胞；cDNA文库；基因表达[中图法分类号][文献标志码]A[基金项目]重庆市卫生局科研基金(2008-2-232)[通信作者]季平，Ｅ-mail:jiping_62@hotmail.com肿瘤干细胞假说认为，肿瘤内存在一小部分细胞与肿瘤的发生、发展及转

3、移密切相关。它们与正常组织干细胞具有相似的生物学特性，因而称为“肿瘤干细胞”[1-2]，越来越多的证据也证实了肿瘤干细胞的存在[3-4]。在头颈部鳞癌中，利用醛脱氢酶(ALDH)作为标志物能够有效富集肿瘤干细胞，与ALDH低表达(ALDHlow)细胞相比，高表达ALDH的肿瘤细胞(ALDHbr)具有较强的放疗抗性，能够以极低的数量在免疫缺陷小鼠体内成瘤，表现出肿瘤干细胞的性质[5-6]。为了进一步探寻肿瘤干细胞的特异性标志物，深入研究其生物特性以期阐明肿瘤的发生机制，我们利用抑制消减杂交(suppressionsubtractivehybridization，

4、SSH)技术成功构建了舌鳞癌ALDHbr与ALDHlow细胞的正、反向差异表达cDNA文库。本实验利用分子生物学及生物信息学技术对构建的差异文库进行初步克隆、鉴定和分析，为深入探寻肿瘤干细胞的特异标志物奠定基础。1材料与方法1.1材料人舌鳞癌细胞株Tca8113购自四川大学口腔疾病研究国家重点实验室。RPMI1640培养基、小牛血清、0.25%胰酶消化液(Gibco)，ALDEFLUOR(StemCellTechnologies,Durham,NC,USA),PCR-SelectTMcDNASubtractionkit(Clontech公司),PMD-18T载

5、体（宝生物工程（大连）有限公司）；FACSAria流式细胞仪(BD公司，美国)。1.2差异表达cDNA文库的构建利用流式激活细胞分选（FACS）技术从舌鳞癌细胞株Tca8113中分选ALDHbr和ALDHlow细胞，按PCR-SelectTMcDNASubtractionkit推荐步骤进行两亚群细胞的消减杂交及PCR扩增，分别得到ALDHbr和ALDHlow细胞差异表达基因的正、反向文库。1.3消减cDNA文库的扩增及鉴定取正、反向文库中的PCR产物连接质粒并转化感受态大肠杆菌，将菌液均匀分别涂布于90mm平板上，37℃倒置培养过夜。待菌落显色完全，随机挑取2

6、40个白色菌落分别接种到LB液体培养基培养过夜，对其中48个菌落培养产物进行PCR扩增并利用2%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。1.4差异表达cDNA测序及同源性分析将得到的阳性克隆菌液送北京六合华大基因公司测序。将测序所得的cDNA序列去除载体、扩增引物，利用NCBI的Blast2.2.25进行核苷酸序列同源性比对获得已知基因，并查阅相关文献从中筛选已报道的干细胞相关基因。1.6干细胞相关基因的生物信息学分析筛选出的干细胞相关基因利用GeneOntology数据库(http://www.geneontology.org/)进行功能注释,在KEGGpathway数据库

7、中查询干细胞相关基因参与的信号通路。2结果2.1文库鉴定结果对正、反向两个文库中随机挑选的48个白色克隆进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示检测的克隆均为有插入片段的阳性克隆，插入片段大小分布在200～800bp（图1、2）。1234567891011121314151617181920212223242500bp1500bp1000bp750bp500bp200bp100bp1～24：白色克隆图1正向消减文库中白色克隆PCR扩增结果1234567891011121314151617181920212223242500bp1500bp1000bp750bp500

8、bp200bp100bp1～24：白色