甘氨鹅脱氧胆酸诱导肺泡上皮细胞a549自噬信号改变的实验研究

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1、甘氨鹅脱氧胆酸诱导肺泡上皮细胞A549自噬信号改变的实验研究吴芳，李宛卫，宋瑶，陈龙，史源，胡章雪*通讯作者：胡章雪（1979-），男，博士，副主任医师，硕士生导师，主要从事新生儿临床工作及研究，E-mail:huzxl@163.com（第三军医大学大坪医院儿科）摘要：目的探讨自噬/溶酶体凋亡信号在甘氨鹅脱氧胆酸处理的AECII什么细胞？首次出现英文缩写请标志清楚（肺泡II型上皮细胞）？中的变化及作用。方法：甘氨鹅脱氧酶处理肺泡上皮A549细胞后，检测自噬途径的标志蛋白LC3II浓度、细胞内钙浓度及溶酶体酶PH值。结

2、果甘氨鹅脱氧胆酸抑制A549自噬启动蛋白LC3II的表达、增加A549胞内Ca2+浓度、降低溶酶体PH值结论和结果不相符。。结论甘氨鹅脱氧胆酸会影响肺泡上皮细胞自噬相关蛋白表达，损伤溶酶体活性和通透性，可能导致细胞死亡。关键词：自噬/溶酶体；甘氨鹅脱氧胆酸；肺泡上皮细胞；细胞凋亡胆酸是人体中非常重要的功能分子，其经典作用是在肠道中辅助脂肪类营养物质的吸收。但是新近的研究发现胆酸的生理作用不仅于此，胆酸可作为重要的信号分子调节体内的糖代谢与脂代谢，并可能通过胆酸受体发挥更多的生理功能什么功能？。胆酸的另一个重要生理功能

3、是诱导细胞死亡，其主要细胞毒性成分甘氨鹅脱氧胆酸即可诱导肝脏细胞凋亡，并与肝硬化等疾病的发生显著相关（如何相关）。胆酸肺损伤胆酸肺损伤引入太突兀，和前文的关系？也是临床中非常常见的一种肺损伤类型，比如胆汁返流性肺损伤可诱发严重的急性呼吸窘迫综合征，临床危害极大。在新生儿疾病中，胆酸性肺损伤[1]被认为与胎粪吸入综合征，妊娠肝内胆汁淤积综合征相关性新生儿肺损伤等疾病密切相关如何相关[2]。资料表明妊娠肝内胆汁淤积症（ICP）目前所分娩的新生儿患NRDS首次出现英文缩写请标志清楚全称，呼吸窘迫综合征？的发病率显著增加，目

4、前机制尚不完全清楚。我们的体外实验发现：甘氨鹅脱氧胆酸可诱导肺泡上皮细胞死亡，死亡方式包括凋亡和坏死，而且可显著减少AECII中PS（全称，肺表面活性物质？）的合成[3-4]。作为诱导细胞死亡的重要目前尚没有研究报道胆酸对于肺泡上皮细胞自噬的影响，什么逻辑？因为自噬是细胞新陈代谢中非常重要的生理机制，自噬水平过低或过强均有可能导致细胞功能出现严重障碍，本研究拟通过细胞实验检测GCDC全称？或在前面首次出现中文时标识清楚诱导A549细胞自噬相关基因、细胞内钙浓度及PH值的变化，探讨自噬/溶酶体凋亡途径在胆酸诱导AECI

5、I凋亡中的作用，以进一步揭示胆酸过高造成新生儿呼吸窘迫综合征的发病机制。1.材料与方法1.1材料1.1.1细胞株人肺癌上皮细胞株A549细胞，购自上海中科院细胞所。1.1.2仪器与试剂荧光显微镜；离心机，细胞培养箱，胎牛血清,DMEM培养基（美国GIBCO公司）；甘氨鹅脱氧胆酸盐（sigma公司），LC3II，actin抗体（cellsignaling公司）。1.2方法1.2.1A549细胞培养将A549细胞培养于10%FBS/DMEM培养于37℃，5%CO2培养箱中，常规消化传代。1.2.2westernblot方

6、法检测：用胰酶消化后接种于24孔板中（约1×105cells/孔）。24h后，加入GCDC，使终浓度分别为0.25、0.5、1.0mM，溶剂水为对照组，培养24H，收集各GCDC实验组和对照组细胞，采用westernblot方法进行检测自噬途径的标志蛋白LC3II。使用RIPA缓冲液(150mMNaCl,50mMTRIS-HCl,0.35%sodiumdeoxycholate,1mMEDTA,1%NP40,1mMPMSF,5mg/mlaprotinin,5mg/mlleupeptin)。制备8%SDS-PAGE分离胶

7、，5%堆积胶，以80V恒压电泳。290mA，转膜2h，封闭液（5%脱脂牛奶/PBS）封闭1小时。5%BSA/PBS稀释的兔抗LC3II抗体，室温孵育1h（1:2000）。0.1%TritonX-100/PBS洗膜10min×2次。5%BSA/PBS稀释的Anti-rabbitIgG-HRPantibody室温孵育1h。0.1%TritonX-100/PBS洗膜10min×3次，按ECL说明书配制ECL液，孵育膜5min。暗室中显影。1.1.1细胞内Ca2+（上标）浓度检测：0.2mMGCDC处理A549细胞后不同时间

8、收集细胞，用0.25％台盼蓝染色，计数活细胞为95％以上，细胞悬液37℃预温5分钟，加入终浓度5μmol/LFura－2/AM，37℃，恒温振荡45分钟，持续通95％O2（下标）、5％CO2混合气，以一定量HPSS终止反应，1000转/分离心5分钟，弃上清，再次洗一次（同上），最后细胞悬液于HPSS中调整细胞数为2×106个/ml，每次测Ca2