核糖核酸酶抑制因子过表达抑制b16细胞的侵袭和转移

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1、核糖核酸酶抑制因子过表达抑制B16细胞的侵袭和转移潘湘阳,李红彦，姚雪，熊冬梅，陈俊霞（400016重庆，重庆医科大学细胞生物学与遗传学教研室，分子医学与肿瘤研究中心）［摘要］目的构建人核糖核酸酶抑制因子（ribonucleaseinhibitor，RI）真核表达载体，检测其对B16细胞迁移和侵袭能力的影响。方法提取人7703细胞中的总RNA，RT-PCR特异性扩增RI编码区序列，利用基因重组技术将其克隆到载体pIRES2-EGFP中，稳定转染B16细胞以后，经G418筛选出阳性克隆。根据转染质粒不同分别命名为B16细胞组(未转染组)、空质粒对照组（pIRES2

2、-EGFP组）和实验组（pIRES2-EGFP-RI组）。RT-PCR检测B16细胞中RImRNA水平的表达,并通过Westernblot和细胞免疫化学检测RI蛋白水平的表达；HE染色观察细胞形态的改变，黏附实验、划痕实验和Transwell法检测细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化；Westernblot检测MMP-2、MMP-9和nm23-H1以及E-Cadherin的表达；建立C57BL/6小鼠肺转移模型，观察肺上肿瘤转移灶的变化。结果酶切和测序结果证明重组质粒构建成功，实验组细胞RI的mRNA和蛋白的表达较B16细胞组和空质粒对照组显著升高（P<0.05）；H

3、E染色结果显示，细胞铺展良好，核质比减小；转染pIRES2-EGFP-RI质粒的实验组细胞的黏附，迁移及侵袭能力明显降低（P<0.05）；与两对照组相比，实验组细胞MMP-2和MMP-9的表达水平明显降低，nm23-H1和E-Cadherin的表达水平明显升高（P<0.05）；动物实验显示与对照组相比，实验组的肺转移灶明显减少。结论成功构建的RI真核表达质粒能升高RI基因及蛋白水平的表达，显著抑制了B16细胞的转移和侵袭能力。[关键词]核糖核酸酶抑制因子；B16黑色素瘤细胞；细胞黏附；迁移细胞运动；肿瘤转移；肿瘤侵润侵袭[中图法分类号]R394.2；R739.5

4、［文献标志码］ATheOverexpressionofHumanribonucleaseinhibitorInhibitingInvasionandMetastasisofB16MelanomaCellsPanXiangyang,LiHongyan，YaoXue，XiongDongmei,ChenJunxia(DepartmentofCellBiologyandGenetics,ChongqingMedicalUniversity；MolecularMedicineandCancerResearchCenter,Chongqing400016,China)[Ab

5、stract]ObjectiveToconstructthehumanribonucleaseinhibitor(RI)eukaryoticexpressionvectorandinvestigatetheeffectofRIoverexpressionontheinvasionandmetastasisofB16cells.MethodsTotalRNAwasextractedfromhuman7703cellsbyTrizolreagents,theRIcDNAfragmentwasamplifiedbyRT-PCRandtheDNAfragmentwasi

6、nsertedintotheeukaryoticexpressionvectorpIRES2-EGFPwithDNArecombinanttechniques.ThenthevectorsweretransfectedintoB16cellsandpositivecloneswerescreenedwithG418.TheefficiencyofRIgenesoverexpressionwasdeterminedbyRT-PCR,Westernblotandimmunocytochemicalmethod.B16cellswereobservedformorph

7、ologicalchangesbyHEstaining,anddeterminedforadhesionabilitybyadhesiontest,formetastasisabilitybywoundhealingassay,andforinvasionabilitybytranswellinvasionassay.TheexpressionofMMP-2,MMP-9andnm23-H1andE-Cadherinweredetectedbywesternblot;Thechangesoflungmetastasisnodulewereobserveredbyc

8、onstructingt