uti抑制骨肉瘤细胞侵袭与转移的实验研究论文

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1、UTI抑制骨肉瘤细胞侵袭与转移的实验研究论文张衣北,陈安民,郭风劲【摘要】目的体外研究尿胰蛋白酶抑制剂（urinarytrypsininhibitor,UTI）抑制人骨肉瘤细胞系MG63细胞的侵袭与转移。方法在体外培养的MG63细胞培养基中加入不同浓度的UTI，对照组中加入50μlPBS缓冲液，用免疫组化、RTPCR和时，抑制作用明显（P0.05），并且呈剂量依赖性。结论UTI不但从mRNA水平.freelentalStudyontheSuppressionoftheInvasionandMetastasisofOsteosarabyUT

2、IDepartmentofOrthopedics,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,G63bytheurinarytrypsininhibitor(UTI)invitro.MethodsDifferentdoses（10、50、100、300、500nM）ofUTIanosteosaraMG63mediumand50μlPBSetime,thentheexpressionofurokinasetypeplasminogen

3、activator(UPA)munohistochemistry,RTPCRand,thesuppressionanners.ConclusionTheUTIcansuppressefficientlytheexpressionofproteinUPAbothatthemRNAlevelandattheproteinlevel,thensuppresstheinvasionandmetastasisinosteosaracells.Keyinogenactivator;Osteosara骨肉瘤是一种恶性度高和破坏性强的肿瘤，常在早期就发生侵

4、袭与转移。在这种复杂且多步骤的侵袭与转移过程中，肿瘤细胞水解细胞外基质是一个非常关键的步骤，有一系列蛋白酶的参与1。在这些蛋白酶中，以尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinasetypeplasminogenactivator，ＵＰＡ）尤为重要2。因此，如何减少肿瘤细胞产生UPA，对抑制肿瘤的侵袭与转移具有十分重要的意义。1材料与方法1.1主要实验材料与仪器人骨肉瘤细胞系MG63由武汉大学生命科学院提供；SP试剂盒和AEC显色试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司；RTPCR试剂盒和EM培养基及新生小牛血清购自美国GibcoBRL公司；UPA多

5、克隆抗体和UTI购自Sigma公司。1.2实验方法1.2.1细胞培养传代后的人骨肉瘤细胞系MG63接种于含10%新生小牛血清的DMEM培养液中，分别加入不同浓度（10、50、100、300、500nM）的UTI,而空白对照组加入50μlPBS缓冲液。在37℃、5%CO2、95%湿度下培养24h，然后分别收集培养液及细胞检测。1.2.2免疫组化染色用4％多聚甲醛固定实验组和对照组细胞爬片，然后用SP免疫组织化学染色方法染色（步骤根据说明书进行），并用AEC显色试剂盒显色。胞质或胞核被染成红色为阳性，无着色者视为阴性。封片后照相。1.2.3RT

6、PCR检测UPAmRNA的表达提取细胞总RNA，以Oligo(dT)18为引物，用逆转录酶AMV于47℃逆转录为cDNA。以cDNA为模板用PCR检测UPA基因的表达，所用引物为：上游5GACACGCTTGCTCACC3,下游3CACCTACACGGGACTT5,产物长度为278bp；对照β肌动蛋白(βactin)所用引物：上游5ACTGGGACGATATGGAGAA3，下游3TCCAGTAGTGATAGCCGTT5，产物长度为533bp。PCR反应条件：95℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，循环34次

7、,72℃延伸10min。PCR反应结束后取5μl扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳。1.2.4Tris·Cl+100mMNaCl+0.1%Tin，以BCIP／NBT(武汉博士德)显色系统检测条带，以βactin为内对照。1.2.5图像处理免疫组化图像用HPIAS1000高清晰度彩色病理图像分析系统（华中科技大学同济医学院病理教研室）分析，10×40光镜下随机选择5个视野,测其平均吸光度值(A)，扣除背景及阴性值，免疫组化产物染色越深，灰度值越小，抗原物质的含量就越高。RTPCR及G63细胞分泌的尿激酶型纤溶酶原激活剂（UPA）蛋白在胞质或

8、胞核中被染成红色，见图1。通过HPIAS1000高清晰度彩色病理图像分析系统分析，随着加入的UTI浓度的增高，各组UPA的A值逐渐增高，当UTI的浓