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1、实时荧光定量PCR在中药材薪蛇中的鉴别应用黄林杰罗达龙黄琳(梧州食品药品检验所广西梧州543002)【摘要】目的:探讨实时荧光定量PCR对薪蛇样品真伪鉴别的准确性。方法:采用实时荧光定量PCR法从薪蛇正品、混伪品中提取DNA,进行引物扩增,并通过Cq值和扩增曲线对样品真伪进行判断。结果:3批嶄蛇正品的Cq值均低于30,曲线有明显的指数增长期;2批混伪品无Cq值,曲线为一育•线。结论:木方法鉴别薪蛇操作简单,准确率高,重现性好,可行有效。【关键词】实时荧光定量;PCR;薪蛇;鉴别【中图分类号】R28【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2016)16-0045-02Applicatio
2、nofreal-timefluorescentquantitativePCRintheIdentificationoftraditionalChinesemedicineAgkistrodonAcutusHuangLinjie^uoDalong^uangLin.WuzhoulnstituteforFoodandDrugControl,Guangxi,Wuzhou543002,China[Abstract】ObjectiveToinvestigatetheaccuracyofreal-timefluorescencequantitativePCRintheidentificationofthes
3、amplesofAgkistrodonacutus.MethodsDNAoftheAgkistrodonAcutusanditsadulterantswereextractedbyreal-timefluoresceneequantitativePCR,andprimerswereamplified.AndthroughtheCqvalueandamplificationcurvetodeterminetheauthenticityofthesample.ResultThe3batchesofAgkistrodonauthentic’sCqvalueswerelowerthan30,andth
4、eCurvehadobviousgrowthperiod.TherewasnoCqvalue,andthecurvewasastraightlineforthe2batchesofmixedadulterants.ConelusionThismethodissimpletoidentifyAgkistrodonAcutus,highaccuracy,goodreproducibility,feasibleandeffective.【Keywords]Real-timefluorescencequantitative;PCR;Agkistrodonacutus;Identification薪蛇为
5、为蛭科类动物五步蛇的干燥体,具有祛风、通络、止痉的功效⑴。由于其药用价值较高,导致近年来被大量捕捉,药材资源不断减少,人量伪品充斥着市场,质量问题日益严重。传统的薪蛇药材的鉴别,主要是对其头部、鳞片和骨骼的形态特征进行性状鉴别,这对实验人员的中药材鉴别经验及薪蛇药材的完整性要求较高。随着分子生物学的发展,使得中药材的分子遗传标记鉴别成为可能。目前,文献上已有聚合酶链式反应(PCR)法应用于药材鉴别的介绍。本文采用实吋荧光定量PCR(以下简称qPCR),通过硅胶柱法提取薪蛇的DNA,利用PCR荧光探针法鉴别真伪,较普通PCR法(电泳法)具有操作简单、吋间短、准确率高,不易造成污染的特点,具有较好
6、的应用前景。1•材料与仪器1.1材料1.1.1薪蛇正品及伪品薪蛇正品1、2来源于安徽亳州中药材市场,薪蛇正品3及混伪品金钱白花蛇、赤链蛇均来源于广西玉林中药材市场,并经过形态学鉴定。1丄2试剂动物组织基因组DNA提取试剂盒(购自广州迪奥生物科技有限公司,型号:DePureTissueDNAKit),SuperReal荧光定量预混试剂增强版(购自TIANGEN,型号:FP205),内含2xSuperRealPreMixPlus(withSYBRGreenI)和RNase-FreeddH2O,薪蛇引物(购自invitrogen,型号:A12925,序列:5-GGCAATTCACTACACAGCCA
7、ACATCAACT-3和5-CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC-3)1.2仪器Minispin台式高速离心机(德国Eppendorf公司)、MINIB-100F恒温金属浴(杭州米欧仪器有限公司)、XA205DU电子天平(德国梅特勒托利多公司)、LightCycler96荧光定量PCR仪(瑞士罗氏公司)、・20°C冰箱(美的公司)。2方法2.1引物稀释按产品引物合成说明书,所需引物浓度