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1、实时荧光定量PCR在中药材薪蛇中的鉴别应用黄林杰罗达龙黄琳(梧州食品药品检验所广西梧州543002)【摘要】目的：探讨实时荧光定量PCR对薪蛇样品真伪鉴别的准确性。方法：采用实时荧光定量PCR法从薪蛇正品、混伪品中提取DNA,进行引物扩增，并通过Cq值和扩增曲线对样品真伪进行判断。结果：3批嶄蛇正品的Cq值均低于30,曲线有明显的指数增长期；2批混伪品无Cq值，曲线为一育•线。结论：木方法鉴别薪蛇操作简单，准确率高，重现性好，可行有效。【关键词】实时荧光定量；PCR；薪蛇；鉴别【中图分类号】R28【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2016)16-0045-02Applicatio
2、nofreal-timefluorescentquantitativePCRintheIdentificationoftraditionalChinesemedicineAgkistrodonAcutusHuangLinjie^uoDalong^uangLin.WuzhoulnstituteforFoodandDrugControl,Guangxi,Wuzhou543002,China[Abstract】ObjectiveToinvestigatetheaccuracyofreal-timefluorescencequantitativePCRintheidentificationofthes
3、amplesofAgkistrodonacutus.MethodsDNAoftheAgkistrodonAcutusanditsadulterantswereextractedbyreal-timefluoresceneequantitativePCR,andprimerswereamplified.AndthroughtheCqvalueandamplificationcurvetodeterminetheauthenticityofthesample.ResultThe3batchesofAgkistrodonauthentic’sCqvalueswerelowerthan30,andth
4、eCurvehadobviousgrowthperiod.TherewasnoCqvalue,andthecurvewasastraightlineforthe2batchesofmixedadulterants.ConelusionThismethodissimpletoidentifyAgkistrodonAcutus,highaccuracy,goodreproducibility,feasibleandeffective.【Keywords]Real-timefluorescencequantitative;PCR;Agkistrodonacutus;Identification薪蛇为
5、为蛭科类动物五步蛇的干燥体，具有祛风、通络、止痉的功效⑴。由于其药用价值较高，导致近年来被大量捕捉，药材资源不断减少，人量伪品充斥着市场，质量问题日益严重。传统的薪蛇药材的鉴别，主要是对其头部、鳞片和骨骼的形态特征进行性状鉴别，这对实验人员的中药材鉴别经验及薪蛇药材的完整性要求较高。随着分子生物学的发展，使得中药材的分子遗传标记鉴别成为可能。目前，文献上已有聚合酶链式反应（PCR）法应用于药材鉴别的介绍。本文采用实吋荧光定量PCR（以下简称qPCR）,通过硅胶柱法提取薪蛇的DNA,利用PCR荧光探针法鉴别真伪，较普通PCR法（电泳法）具有操作简单、吋间短、准确率高，不易造成污染的特点，具有较好
6、的应用前景。1•材料与仪器1.1材料1.1.1薪蛇正品及伪品薪蛇正品1、2来源于安徽亳州中药材市场，薪蛇正品3及混伪品金钱白花蛇、赤链蛇均来源于广西玉林中药材市场，并经过形态学鉴定。1丄2试剂动物组织基因组DNA提取试剂盒（购自广州迪奥生物科技有限公司，型号：DePureTissueDNAKit）,SuperReal荧光定量预混试剂增强版（购自TIANGEN,型号：FP205）,内含2xSuperRealPreMixPlus（withSYBRGreenI）和RNase-FreeddH2O,薪蛇引物（购自invitrogen,型号：A12925,序列:5-GGCAATTCACTACACAGCCA
7、ACATCAACT-3和5-CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC-3）1.2仪器Minispin台式高速离心机（德国Eppendorf公司）、MINIB-100F恒温金属浴（杭州米欧仪器有限公司）、XA205DU电子天平（德国梅特勒托利多公司）、LightCycler96荧光定量PCR仪（瑞士罗氏公司）、・20°C冰箱（美的公司）。2方法2.1引物稀释按产品引物合成说明书，所需引物浓度
